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1、第一讲 微生物的培养与利用、分离与计数知识点一 微生物的实验室培养1培养基的成分和分类(1)(2)分类Error!Error!2连线无菌技术的类型、方法及对象3纯化大肠杆菌(1)制备固体培养基的流程：计算称量溶化灭菌倒平板(2)纯化方法Error!Error!知识点二 土壤中分解尿素细菌的分离和计数(1)菌种筛选：使用尿素是唯一氮源的选择培养基培养。(2)统计菌落数目：常用方法有稀释涂布平板法、显微镜直接计数法。(3)细菌分离与计数的实验流程：土壤取样配制培养基微生物的培养与观察细菌的计数。知识点三 分解纤维素的微生物的分离1纤维素酶(1)组成：一种复合酶，它至少包括三种组分，即 C1酶、CX
2、酶和葡萄糖苷酶。(2)作用：纤维素纤维二糖葡萄糖。C1酶CX酶葡萄糖苷酶2筛选方法(1)方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(2)培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。3实验流程土壤取样：富含纤维素的环境：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量选择培养梯度稀释涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈一、理解运用能力判断下列叙述的正误。(1)根据物理状态的不同，培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型()(2)培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分()(3)在配制培养基时，除满足营养需求外，还应
3、考虑 pH、O2及特殊营养物质的需求()(4)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素()(5)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源()(6)统计样品中的活菌一般用平板划线法()(7)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌()(8)刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物()(9)纤维素酶只包括三种组分：C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶()(10)筛选分解纤维素的微生物的培养基中是以纤维素为唯一碳源的选择培养基()二、图表分析能力下表为筛选分解尿素细菌的培养基，据此回答问题：KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素琼脂1.4 g21
4、g02 g100 g10 g150 g将上述物质溶解后，用自来水定容到 1 000 mL(1)在该培养基中尿素的作用是什么？琼脂的作用是什么？答案：尿素作唯一氮源，起选择作用；琼脂作为凝固剂，用于制备固体培养基。(2)对筛选出的细菌要进行进一步的鉴定，如何鉴定？答案：在培养基中再加入酚红指示剂，培养细菌后，pH 升高，指示剂将变红。理清脉络考点一|培养基及微生物的纯化培养技术1培养基的种类(1)按物理状态分类：培养基种类特点用途液体培养基不加凝固剂工业生产固体培养基加凝固剂(如琼脂)微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏(2)按功能分类：种类制备方法原理用途举例选择培养基培养基中加入某些化学物质
5、依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计 从众多微生物中分离所需的微生物加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌 鉴别培养基培养基中加入某种产生特定的颜色或其他鉴别不同种类的微用伊红美蓝培养指示剂或化学药品变化 生物 基鉴别大肠杆菌 2.微生物的纯化培养方法平板划线法稀释涂布平板法注意事项(1)接种环的灼烧：第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者(2)灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种(3)划线时最后一区域不要与第一区域相连(4)划线用力要大小适当，防止用力
6、过大将培养基划破(1)稀释操作时：每支试管及其中的 9 mL 水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰 12 cm 处(2)涂布平板时：涂布器用体积分数为 70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体典例 1 (2014乐山测试)下图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为 1、2、3、4、5。下列叙述正确的是( )A在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌B划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上C接种时不能划破培养基，否
7、则难以达到分离单菌落的目的D第 1 区和第 5 区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数解析 在每次划线前后都要对接种环进行灭菌；进行划线操作时，左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的；第 1 区和第 5 区的划线不能相连。答案 C1消毒和灭菌的辨析条件结果常用方法应用范围煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属工具灭菌强烈的理
8、化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子高压蒸汽灭菌法培养基及容器的灭菌2并非所有生物所需的营养物质都相同(1)微生物需要的营养成分有水、无机盐、碳源、氮源，有些微生物还需要特殊营养物质，如生长因子。(2)在人和动物中，营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。(3)在植物中，营养物质包括矿质元素、水、二氧化碳三类。针对练习高考命题常从以下角度设置陷阱(1)从各种相近的选项中直接筛选消毒或灭菌的方法。(2)给定操作对象，据此选择合适的消毒、灭菌方法。1除了高温加热以外，其他灭菌方法还有( )A紫外线照射 B真空包装C用保鲜膜密闭 D添加防腐剂解析：选 A 灭菌是使用强烈的理
9、化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。真空包装、添加防腐剂、用保鲜膜密闭都只起到了抑菌作用，而紫外线照射使细菌的蛋白质变性，核酸受破坏，是灭菌方法。2细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )A接种环、手、培养基 B高压锅、手、接种环C培养基、手、接种环 D接种环、手、高压锅解析：选 C 一般说来灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，如操作者的手臂需要消毒处理。高压蒸汽灭菌锅是灭菌设备，通常
10、用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。考点二|微生物的筛选与计数1筛选菌株(1)原则：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。(2)菌株筛选原理的比较：土壤中分解尿素的细菌分解纤维素的微生物选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂， 若指示剂变红，pH 升高，说明细菌能分解尿素选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳源鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈2.统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数
11、法：原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)：原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M，其中，C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M 代表稀释倍数。操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300 的平板进行计数。典例 2 (2014达州
12、质检)利用农作物秸秆为原料可生产乙醇，生产过程中可采用微生物将秸秆水解或用酶水解，其主要技术流程如下图所示，下列相关说法错误的是( )秸秆秸秆碎屑反应罐水解压滤出渣酒精发酵真空分馏A可用刚果红染色法筛选过程所需的纤维素分解菌B过程加入的纤维素酶是葡萄糖苷酶C酒精发酵接种的酵母菌需在无氧条件下发酵D酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌解析 筛选纤维素分解菌可采用刚果红染色法；纤维素酶为复合酶，至少包含三种组分，C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶；酒精发酵需在无氧条件下进行；酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌。答案 B1分离微生物所用的选择培养基一定是固体培养基，因为菌落只能在固体培养基上形成。2平板划
13、线法只适合用于微生物的提纯，不适合进行计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。3分离能分解纤维素的微生物时，有时需要进行选择培养，选择培养的目的是增大选择对象在样液中的浓度，以确保用刚果红染色法鉴别时确实能得到所需菌种。选择培养基的应用(1)选择培养基在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。目的是培养、分离出特定微生物。(2)选择培养基应用实例：培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。培养基中缺乏氮源时，可以分离得到固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分
14、时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。针对练习3通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入 10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出( )大肠杆菌 霉菌 放线菌 固氮细菌A BC D只有解析：选 A 缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法
15、生长，而固氮细菌能生长；在培养基中加青霉素可以抑制细菌和放线菌等原核生物细胞壁的合成，而霉菌属于真核生物，故能生长；在培养基中加入 10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长，对放线菌的生长无影响。课堂对点练题组一 微生物的培养和纯化1(2013江苏高考)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是( )A培养基分装到培养皿后进行灭菌B转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线C接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养D培养过程中每隔一周观察一次解析：选 B 培养微生物过程中应先灭菌再倒平板；每一次划线前都要进行接种环的灼烧灭菌；接种后的培养皿应在恒温培养箱中进行培养，光照会影响温度等条件；培
16、养过程中观察间隔的时间一般不超过 24 h。2(2012北京高考)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是( )A将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中B将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上C将转基因植物叶片接种到无菌培养基上D将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上解析：选 C 将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中进行酿酒时，在缺氧、酸性环境下其他杂菌不能生长，故不严格灭菌对其影响不大；腐乳制作中将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上，毛霉生长繁殖快且抗杂菌能力强，故不严格灭菌对实验结果影响不大；进行植物组织培养时，植物材料体积小、抗性差，而微生物繁殖快、生长迅速、会争夺培养基中的营养，产生的代谢废物还会毒害培养材料，故培
