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1、,DNA重组与基因工程 DNA recombination and gene engineering,第一节 自然界的基因转移和重组,一、在细菌中遗传物质转移 接合(conjugation) 转化(tranformation) 转导(transduction),E.coli 接合的发现:1946年莱德伯格(Lederberg, J.) 和塔特姆 (Tatum) 发现细菌的接合（conjugation）。细菌接合：指通过细胞的直接接触(如菌毛) ，遗传信息从供体细胞单向转移到受体细胞的过程。,（一）接合作用 (conjugation ),接合,转移,F因子,染色体DNA,性鞭毛,Griffith
2、 experiment on pneumococcal transformation: (1) Mice are resistant to Type R Streptococcus pneumoniae bacteria, but (b) are killed by injection with virulent Type S S. pneumoniae bacteria. (c) Injection with heat-killed virulent bacteria does not kill mice, but (d) if heat-killed Type S bacteria are
3、 mixed with nonvirulent Type R bacteria, they have the capacity to transform nonvirulent Type R bacteria into the virulent Type S form,（二）转化（transformation）,图 15-3 转导作用,（三）转导（transduction）：,通过病毒（噬菌体）介导发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移和重组过程。,溶菌途径,溶原途径,噬菌体感染宿主后的两种结局,二、DNA重组,概念： 不同DNA之间发生共价连接形成新的DNA 分子。 基因重组和移动是生物界
4、普遍现象，是生物进化的动力，所以DNA重组具有重要的生物学意义 类型： 位点特异性重组（site-specific recombination） 同源重组（homologous recombination） 转座（transposition）,第二节 重组DNA技术,重组DNA技术相关概念及意义 重组DNA技术的原理及过程 重组DNA技术与医学关系,重组DNA技术(recombinant DNA technology)：是指实现基因（或DNA）克隆所采用的方法及技术路线等。又称基因工程（gene engineering），遗传工程（genetic engineering）等。,一、重组DNA技
5、术相关概念及意义,（二）重组DNA技术的意义,填平了物种间不可逾越的鸿沟； 缩短进化时间； 对生物定向改造； 基因结构、结构功能及调控研究的基础； 疾病诊治,二、重组DNA技术的原理及过程,基本过程：,分 切 接 转 筛,（一）工具酶,工具酶：系指能用于DNA和RNA分子的切割，连接，聚合，反转录等有关的酶系统称为工具酶。,常 用 的 工 具 酶,限制性内切核酸酶 (restriction endonucleases) DNA连接酶 (DNA ligase) DNA聚合酶I(DNA polymerase I)多核苷酸激酶 (polynucleotide kinase)反转录酶(reverse
6、transcriptase)DNA末端转移酶(DNA terminal transferase)碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase),在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割将两条以上的线性DNA分子或片段 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体催化DNA 切口平移反应，制备高比活探针； DNA末端标记，合成cDNA的第二链催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的 5OH末端上以RNA为模板合成互补的cDNA链线性双链 或单链DNA分子的3OH末端加上同聚物尾去除DNA,RNA,dNTP的5末端的磷酸基团,工 具 酶 主 要 功 能,（二）基因载体（vector）,载体（vec
7、tor）：携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和/或表达的一类DNA分子。 载体特征： 自主复制 即有复制原点（必需） 酶切位点（必需） 大小适合 筛选标记 如对抗菌素的抗性等 拷贝数高 载体类型： 来源: 质粒；噬菌体；病毒, 酵母人工染色体 功能: 克隆载型体和表达型载体 受体细胞: 原核细胞载体和真核细胞载体(穿梭载体),质粒：细菌染色体外小型双链环状DNA。 质粒复制的类型： 严紧型：1-5拷贝，与细菌复制密切相关 松弛型：10-200拷贝以上 常用载体： pBR322：4.36kb；人工构建 ；Tetr和Ampr；多克隆位点 pUC系列质粒： pBR322和M13噬菌体改建, 2.
8、674kb；Ampr；蓝白斑筛选（lacZ，-肽） 用途： 保存与扩增 2kb的目的基因 构建cDNA文库 测序 制备探针,1、质粒载体,复制点：ori 筛选标记：ampr,tetr 克隆位点：多个单一限制性内切酶位点,2、噬菌体载体（bacterieophage）,基因组特点： 50kb双链DNA分子，末端12bp为互补单链（cos位点，又称粘端） 两个启动子：PR和PL 编码基因：包装蛋白，裂解功能蛋白等 生长方式： 裂菌性生长（组装噬菌体） 溶源性生长（整合入细菌DNA内）,噬菌体载体（Bacteriophage Lambda）,cos,TACGGGGCGGCGACCTCGCG ATGC
9、CCCGCCGCTGGAGCGC,Cos序列及酶切割位点,载体种类： 插入载体（insertion vector）：外源性DNA直接插入酶切位点（EcoR） 容量：几个kb 代表载体：gt10； gt11 用途：构建cDNA文库 替代载体（substitution vector）：外源性DNA替代载体中央部分 酶切位点：EcoR；BamH；Sal 容量：9-22kb 代表载体：EMBL4 用途：构建基因组文库,cos,cos,cos,cos,cos,cos,cI,EcoR I,EcoR I,lacZ,E,B,S,E,B,S,gt10,gt11,EMBL4,噬菌体插入载体和替代载体示意图,3、粘
10、粒载体（cosmid）,基因组组成：质粒与噬菌体的cos位点联合构成、 4-6kb、质粒复制起始位点、酶切位点、抗药性基因； 容量：29-45kb 代表载体： pGEM-3Zf（-） 工作方式：具有噬菌体样的包装和感染，又具有质粒样的复制 用途：基因组文库,（三）目的基因（target gene）,1、目的基因的用途 研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、调控 寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与治疗 研究生物种系进化与相关同源性 基因工程重组表达 改造某些基因，以改良品种 基因治疗,2、获得目的基因的方法,原核目的基因获得：直接分离 真核目的基因获得： 基因组文库筛选 cDNA文库筛选 人工合
11、成 PCR合成,DNA文库概念 ： DNA文库（DNA library）：通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中的各种重组DNA分子的集合体 。 分两类： 基因组文库(genomic library)：将某种生物细胞的基因组DNA切割成一定大小的片段后，分别与合适的载体重组并导入宿主细胞内克隆保存。这种保存在宿主细胞内的整个基因组DNA片段的集合体。 cDNA文库(cDNA library)：将分离纯化获得某种真核细胞中的全部mRNA，并将mRNA逆转录成cDNA，如此获得的cDNA通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中。这种保存在宿主细胞内的cDNA的集合体。,用聚合酶链反应（PCR）方法获取目的基
12、因,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,第一次循环 变性（95oC） 退火（Tm低5oC） 延伸（72oC）,第二次循环,3,5,5,3,3,5,5,3,第三次循环,2530次循环后模板DNA含量可以扩大100万百倍以上,PCR原理,模板DNA,引物,引物,用聚合酶链反应（PCR）方法获取目的基因,一对引物分别含有BamH I 和Hind III 位点，PCR产物经双酶切后，可定向插入载体。,（四）外源基因与载体的连接,作用酶：DNA连接酶 连接方式： 粘性末端连接 平末端 同聚物加尾连接 人工接头,人工接头连接法,（五）重组DNA导入受体菌,1、重组子导入受体菌的方式 ： 转化（
13、transformation）：特指将质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程 转导（transduction ） ：噬菌体及其重组子导入受体细胞（细菌） 转染（tranfection）：病毒及其重组子导入受体细胞（真核细胞）,2、导入方法,氯化钙法感受态 ：细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态制备条件：冰浴、低渗CaCl2 （ 0.1mol/L ）转化反应：冰浴30分短暂热休克（42）转化效率：105-106/ug DNA;环状DNA高于线状DNA 1000倍 电穿孔法：电穿孔仪,（六）重组子的筛选与鉴定,1、阳性菌落筛选： 抗药性标志：ampr、tetr、neor 插入抗性失活
14、 互补筛选：蓝白斑筛选（-互补）、营养缺陷互补 分子杂交：原位杂交、southern blotting 2、插入外源性DNA的鉴定： 酶切（目的片段长度） PCR 测序 3、表达蛋白的鉴定 免疫学、生物学活性,抗药性筛选,多克隆位点,启动子,裂开的N端,裂开的N端,外源DNA, 半乳糖苷酶 N端编码序列,pUC18 2686bp,pUC18 2686bp,染色体,重组体pUC18,细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养,细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养,pUC18,含重组体pUC18的白色菌落,蓝色菌落,含载体pUC18的蓝色菌落, 半乳糖苷酶 C 端编码序列,转化,
15、转化,利用 互补原理筛选（兰白斑筛选）重组子pUC18,蓝白斑筛选重组质粒,外源基因在载体上表达必须具备：强的启动子核糖体结合位点翻译起始和终止位点。,（七）克隆基因的表达,1、原核表达体系,大肠杆菌、枯草杆菌表达系统优点：方法简单、迅速、经济，适合大规 模生产。缺点：但该系统缺乏转录后加工机制，不宜表达真核基因组DNA；缺乏翻译后加工机制，如不能进行糖基化 修饰等；表达的蛋白质通常形成包涵体。,酵母、昆虫、哺乳动物细胞表达系统优点：能转录后加工，即能剪接内含子；能翻译后加工，即能糖基化修饰等；通常不形成包涵体，能正确折叠。缺点：但技术难度较大，成本较高，表达量较低。,2、真核表达体系,第三节 重组DNA与医学的关系,（一）疾病基因的发现 （二）生物制药 （三）DNA诊断 （四）基因治疗 （五）遗传病的预防,重组DNA医药产品,重组DNA技术实例:,
