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1、第二军医大学博士学位论文E G F R 通路与结直肠癌细胞放疗敏感性关系及西妥昔单抗对结直肠癌放疗敏感性的影响R e l a t i o n s h i pb e t w e e nE G F Ra n dr a d i o s e n s i t i v i t ya n dc o m b i n a t i o ne f f e c to fc e t u x i m a bw i t h5 - F ut or a d i o s e n s i t i v i t yo fc o l o r e c t a lc a n c e r研究生：左志贵学科与专业：普通外科学研究方向：肛肠外科指
2、导老师：傅传刚培养单位：第二军医大学长海医院导师组成员：于恩达教授张卫副教授第二军医大学二。一三年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：杉态次日期：万哆年厂月磁日学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位
3、论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：彭惫爰二日期：砷年矿月趔日导师签名日期：沁目录中文摘要O O OOOO OOO QOO OOO 1英文摘要5缩略词表1 1前言OOO OOOOOOOOO OOOOOOOOO OOO 1 3日I J舌“1 3第一部分表皮生长因子通路与结直肠癌细胞放疗敏感性的关系17一、材料OOOOOO 1 7二、方法2 0三、结果3 0四、讨论3 4参考文献3 7第二部分放疗对直肠癌E G F R 表达影响与放疗敏感性和预后的关系3 9一、材料4 0二、方法
4、4 3三、结果4 8四、讨论OOOOOO OOOOOO OOO 6 1参考文献6 5第三部分西妥昔单抗联合氟尿嘧啶对结直肠癌细胞放疗敏感性影响6 7一、材料6 8二、方法000000 7 0三、结果7 5四、讨论eee ee e e6e 8 5参考文献O00000 8 7第四部分西妥昔单抗用于局部进展期直肠癌术前放疗增敏系统回顾8 9参考文献000 000 0 00 0000 0000 9 5总结一O00 QO0 9 9综述一”1 0 1参考文献000000 “1 0 7综述二OOgO00 000000 1 1 1参考文献000000 一“1 1 6论文发表一119致谢一一“”一“”一一121
5、E G F R 通路与结直肠癌细胞放疗敏感性的关系及西妥昔单抗对结直肠癌放疗敏感性的影响摘要E G F R 通路与结直肠癌细胞放疗敏感性的关系及西妥昔单抗对结直肠癌放疗敏感性的影响一、饼究苜景结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，目前在全世界恶性肿瘤的发病率中占第3 位，随着经济发展导致饮食结构的改变，我国结直肠癌发病率呈逐年升高的趋势。根据结直肠肿瘤分期的不同，结直肠癌5 年生存率介于1 0 9 0 之问。直肠是结直肠肿瘤最易发部位，在西方国家中直肠癌约占结直肠癌总发病率4 0 ，而我国却占总发病率的6 0 左右，并以腹膜返折平面以下的中低位直肠癌占大多数。由于直肠癌深处盆腔，与结肠癌相比，直
6、肠癌术后局部复发率高、远期生存率低，而局部进展期直肠癌则预后更差，其5 年生存率位于2 0 4 0 之间。因此，如何有效预防直肠癌术后局部复发和提高直肠癌患者总生存率和无病生存率一直是直肠癌研究的重点。自2 0 世纪8 0 至9 0 年代美国进行的多个肿瘤研究项目显示直肠癌术后放化疗可以减少局部复发率和提高总体生存率以后，手术、放疗和化疗组成了直肠癌综合治疗的三大支柱，2 0 世纪后期手术联合术后放化疗是局部晚期直肠癌患者的经典治疗方案。而近1 0 年来多个大样本多中心临床研究表明术前放化疗与术后相比可以达到提高保肛率、R 0 切除率及进一步减少局部复发率的作用，因此术前放化疗作为局部进展期直
7、肠癌辅助治疗的重要手段目前建议在术前进行，术前放化疗联合手术已经成为局部进展期直肠癌治疗的标准方案，目前多学科综合治疗在提高局部进展期直肠癌总体治疗效果中的作用已经得到公认。根据局部进展期直肠癌患者对术前放化疗的敏感程度制定个性化治疗方案及在放疗过程中联合使用化疗及分子靶向治疗以进一步提高局部进展期中低位直肠癌术前放化疗效果则是目前直肠癌临床研究的热点。E G F R 通路在肿瘤放疗抵抗中的作用既往已有相关研究报道，但E G F R 信号向下转导有两条途径，通路具有多节点性，目前尚无相关研究同时探讨K r a s B r a 卯I K 3 C A突变与结直肠癌放疗敏感性的关系，我们从细胞学水平
8、探讨E G F R 通路多节点与放疗敏感性的关系。由于表皮生长因子与放疗抵抗相关，而氟尿嘧啶目前广泛应用于术前放疗增敏，目前尚无相关研究西妥昔单抗与氟尿嘧啶联合对放疗效果的影响，因此我们分别从细胞水平、结直肠癌肿瘤细胞裸鼠模型并对临床研究进行系统回顾探讨了西妥昔单抗联合氟尿嘧啶对结直肠癌细胞放疗敏感性的影响。第二军医大学博士学位论文二、研究内容第一部分表皮生长因子通路与结直肠癌细胞放射敏感性的关系目的探讨表皮生长因子受体( E G F R ) 表达及其下游通路的关键基因K r a s B r a f P I K 3 C A 突变状态对结直肠癌细胞放射敏感性的影响。方法对9 个人结直肠癌细胞系应
9、用R e a l T i m eR T - P C R 技术及W e s t e r nb l o t t i n g 检测E G F R 在m R N A 水平及蛋白水平的表达高低，同时检测这9 个人结直肠癌细胞系K - r a s 、B r a f , P I K 3 C A的突变状态，对这9 个结直肠癌细胞系行2 G y 剂量射线照射，对照射后的细胞行克隆形成实验明确各细胞株放射敏感特性，照射4 8 小时后行H o e c h s t 3 3 2 5 8 染色凋亡形态学观察，采用流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞周期比例，统计分析结直肠癌细胞E G F R 表达及K r a s 、B r a
10、 f , P I K 3 C A 突变状态与放疗敏感性的关系并分析放疗抵抗及敏感的可能机制。结果相关性分析显示结直肠癌细胞系E G F R 表达与放疗抵抗成正相关( r ：O 7 1 7 ，P = 0 0 3 0 ) ，E G F R 高表达与放疗抵抗相关，而P I K 3 C A 突变与放疗敏感相关n = 2 4 0 1 ，P = 0 0 4 7 ) ，K r a s 、B r a f 突变与放疗抵抗及敏感无关。照射后4 8 h 凋亡检测显示放疗敏感细胞系( H C T l l 6 ) 总凋亡率随放射剂量增加明显增加伊 0 0 5 ) 。结论人结直肠癌细胞系E G F R 高表达与放疗抵抗显
11、著相关，P I K 3 C A突变与放疗敏感显著相关，E G F R 通路多位点同时参与了结直肠癌细胞的放疗抵抗和敏感作用，E G F R 通路参与结直肠癌细胞放疗抵抗机制可能与抑制肿瘤细胞凋亡、增加肿瘤细胞在G 1 G 0 期停顿相关。第二部分放疗对直肠癌E G F R 表达影响与放疗敏感性和预后关系目的分析放疗前后局部进展期中低位直肠癌患者癌组织E G F R 蛋白水平表达的变化，探讨放疗前后E G F R 蛋白表达变化与病理消退及预后的关系，进一步全面研究局部进展期中低位直肠癌患者新辅助治疗后病理消退的临床及病理影响因素。方法对2 0 0 2 年1 月至2 0 0 9 年1 2 月期间1
12、 2 2 例局部进展期中低位直肠癌患者接受新辅助治疗后行手术的临床资料及术后病理消退分级进行回顾性研究，对其中4 6 例患者放疗前后直肠癌组织病理标本进行E G F R 免疫组织化学检测蛋白表达高低，L o g i s t i c 回归分析与直肠癌新辅助治疗后病理消退相关的临床及病理影响因素，生存分析及L o g r a n k 检验探讨E G F R 表达变化及其他临床病理因素与预后的关系，C O X 多因素回归分析与新辅助治疗后直肠癌患者长期生存相关的独立影响因素。结果1 2 2 例患E G F R 通路与结直肠癌细胞放疗敏感性的关系及西妥昔单抗对结直肠癌放疗敏感性的影响者中明显病理消退5
13、 2 例( 4 2 6 2 ) ，其中完全病理消退1 1 例( 9 0 2 ) ，病理消退不明显7 0 例( 5 7 3 8 ) 。同步放化疗患者病理明显消退率为5 4 0 5 ( 4 0 7 4 ) ，高于单纯放疗患者病理明显消退率2 5 ( 1 2 4 8 ) ( X 2 = 1 0 5 ，P = O 0 0 2 ) ，长程放疗方案患者病理明显消退率为6 0 ( 3 0 5 0 ) ，高于短中程放疗患者病理明显消退率3 0 5 6 ( 2 2 7 2 )( X 2 = 1 0 4 6 5 ，P = 0 0 0 5 ) ，放疗总量大于4 0 0 0c G y 患者病理明显消退率为6 0 4
14、2 ( 2 9 4 8 ) ，高于放疗总量小于等于4 0 0 0c G y 患者病理明显消退率3 1 0 8 ( 2 3 7 4 )( X 2 = 1 0 8 8 9 ，P = 0 0 0 2 ) ，放疗后E G F R 表达增加病理明显消退率为2 3 0 3 ( 3 1 3 ) ，低于放疗后E G F R 表达不变或减少患者病理明显消退率6 3 6 4 ( 2 1 3 3 ) ( X 2 = 7 7 6 9 ，P = 0 0 0 5 ) ，多因素L o g i s t i c 回归分析显示同步放化疗、长程放疗及放疗后E G F R 蛋白表达不变或减少是局部进展期直肠癌患者术前新辅助治疗后病理消退分级的三个独立影响因素( P O 0 5 ) 。西妥昔单抗及氟尿嘧啶各自与2 G y 放射线联合均明显提高了2 G
