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1、显微镜及其维护保养,显微镜种类,光学显微镜普通光学显微镜特殊生物显微镜 电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜,主要内容,显微镜的历史 显微镜的光学原理 显微镜的基本参数 显微镜的结构 显微镜的使用 显微镜的维护 特殊生物显微镜 电子显微镜,1 显微镜的历史,16世纪末，荷兰Janssen父子制造第一台原始显微镜。 1610年，意大利Galileo制造了复式显微镜（物镜、目镜、镜筒） 1665年，Robbert Hooke 利用自制的复式显微镜观察软木塞-CELL。不久，荷兰的Leeuwenhoek创造270倍显微镜，广泛观察各种生物。 1684，荷兰Huygens设计出双透镜目镜惠更斯目镜
2、19世纪中叶，Abbe全面提出显微镜成像理论，发明油浸物镜，改造显微镜各种部件 1902年，Ives奠定现代双目镜的基本系统 1935年，Zernike发现相差原理 60年代中期，DIC 显微镜出现,罗伯特虎克制造的显微镜（1665）放大倍数：140倍,列文虎克和他的显微镜（约1680）,2 显微镜的光学原理,3 显微镜的基本参数,3.1分辨率(鉴别距离)：显微镜能分辨的最小距离，用D表示。显微镜的鉴别距离越小，分辨率越高。人眼：0.2mm/250mm 光学显微镜：0.2um 电子显微镜：0.2nm,D：分 辨 率 ：光波的波长 N：介质折射率 ：物镜镜口角,3.2孔径角：由标本上一点发出的进
3、入物镜最边缘光线之间的夹角。 3.3数值孔径：NA = nsin /2,数值孔径与分辨率的关系,3.4放大倍数适合的放大倍数决定于物镜的数值孔径，一船应为数值孔径的5001000倍。 观察倍率(M) = 物镜倍率 X 目镜倍率 照相倍率(M) = 物镜倍率 X 照相目镜倍率 视频系统（M）= (显示器对角线/CCD对角线) X 接口倍率 X 物镜倍率,分辨率与物镜数值孔径、物镜倍数的关系,1010,425,空放大,3.5像差,球差,象散,慧差,场曲,负畸变,正畸变,球差,色差,色差,色差校正,3.6焦点深度 在显微镜的光轴上有一段距离范围内物体被看得清晰。超出这段距离的物体就模糊不清。这段距离
4、位于显微镜焦点的上下很小的范围之内。这段距离的上下限叫焦点深度。,焦点深度,焦点深度,4 - 5 um,2 um,3.7视场数目镜中观察到的物像的一定范围叫视野。视野与显微镜的总放大率成反比。在同一总放大率的条件下视野也可有大小差别。这种差别决定于目镜视场光栏的直径。视场光栏的直径叫目镜的视场数值,目镜的视场,F.N18 F.N22 F.N26.5,3.8工作距离工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。,3.9同焦距（齐焦距离),4 显微镜的结构,组成,光学放大系统,照明系统,机械系统,物
5、镜,光源,反光镜,滤色片,聚光镜,目镜,4.1物镜 (objective) 物镜：决定分辨率 物镜的种类,消色差物镜,平场复消色差物镜,半复消色差物镜,物镜结构,物镜标识,物镜标识,Black Gray Brown Red Yellow Light green Light blue Dark blue White,- 1.25x 2x 2.5x 4x / 5x 10x 20x 40x / 50x 60x 100x -,Magnification,Immersion medium,Indication,无限远光学系统,4.2目镜,眼点,目镜的视场,F.N18 F.N22 F.N26.5,标本的视
6、场直径,标本的视场直径 = 目镜视场数 / 物镜倍率例: WH10X目镜视场数为22物镜为UPLFL40X视场直径 = 22 40 = 0.55 mm,-显微镜下观察到的标本大小,4.3聚光镜使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。,阿贝聚光器,摆入摆出式聚光器,消色差消球差聚光器,聚光镜光栏 所谓光栏，从广义的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可认为光栏。聚光镜光栏作用（1）改变聚光镜的数值孔径以便与物镜的数值孔径相匹配，可调整图象的分辨率和反差。（2）辅助调整亮度。,聚光器数值孔径,机械筒长,视场光阑的调节,1,2,3,4,5 光学显微镜的调节,视场光阑随物镜倍数的增大而缩小
7、小。 聚光镜的高低位置在调节好后不要再调。 在实际使用过程中，作为一般观察不一定要收小或开大视场光阑，但作显微照相时，为了避免杂散光线对照相系统的干扰，应进行调整。,孔径光阑的调节,预调焦机构(限位环),粗调松紧调节旋钮,瞳距调节,屈光度调节,物镜校正环,如观察时视野图像表现为一层模糊的图像，则应该检查校正环的位置正确与否。,如果盖玻片厚度不是0.17毫米，物镜就不能达到最佳性能。在这种情况下，使用一个带校正环的物镜，通过调节校正环，就可以补偿厚度差异。校正范围0.11-0.23毫米。 调节步骤如果知道盖玻片厚度，就把校正环设定到这个数值。如果不知道盖玻片厚度，反复调节校正环和微调焦旋钮，直到
8、获得最高分辨率。 注意，转动物镜转换器时，不要碰 到校正环,物镜校正环,调整不充分,UPLAPO40X,适当调节,起始亮度调节旋钮,6 光学显微镜的使用,取出放于距桌沿 67 cm左右位置。 检查电源开关、光强调节电位器；打开光源开关。 转动物镜转换器，使低倍镜头转入光路。 放玻片标本。 低倍镜观察（4X）。观察之前，先转动粗动调焦手轮，使载物台上升，物镜逐渐接近玻片但勿接触。通过目镜观察，并反向转动粗调焦手轮，使载物台慢慢下降，直到看清物像。 标本所需观察部位移入视野中心。 瞳距调节：左右推拉目镜，使两目镜距离与自己两眼距离相等。,高倍物镜观察：将高倍物镜转入光路（齐焦，换高倍物镜应可以见到
9、物像，但物像不一定很清晰），微动调焦手轮进行调节。若看不到标本勿调节粗调和微调。 屈光度调节 亮度调节、聚光镜光阑的大小调节和聚光器的高度调节，使图象效果最好。 继续观察：低倍物镜转入光路，换标本。 观察完毕，将物镜镜头从光路移开或低倍物镜移入光路，并检查物镜是否沾水沾油，亮度调节电位器调到最小，关闭电源开关。,7 光学显微镜的维护,显微镜要轻拿轻放。 严禁将表面有水的载片放到显微镜上。 从低倍转入高倍应能看到图象，否则需转入低倍另行调节、查找原因。 临时不用显微镜只需将光源亮度调至最低而无需关闭。忌频繁开关显微镜电源。 镜头脏污只能用专用工具经专门程序清洗。 使用完毕等灯箱冷却后罩上防尘罩或
10、放入箱内，并存于干燥无尘处。,灯泡寿命,卤素灯、钨丝灯光源开关电源时，应将亮度调至最小。 汞灯光源点亮后至少点灯15分，关闭后等待3-5分再开。,6V15W 6V30W,6V10W 6V20W 6V30W 12V50W 12V100W,120V30W 220V20W,清洁工具,清洁液配方：1份无水乙醇3份乙醚,擦拭方法,严禁干擦，用量适当,注意,塑料表面勿用乙醇乙醚混合液擦洗。 严禁用干擦镜纸擦拭镜头。 清洗液用量适当。 物镜严禁拆卸并防止振动。 目镜、聚光镜拆卸时注意透镜上下面。 打开电源前应将亮度调节电位器调至最小。,8 显微摄影,彩色显微摄影 定制规定电压 9V色温转换滤色片 LBD,电
11、压、色温、滤色片,黑白显微摄影 反差的滤色片,光 源,N-D 滤色片,改变反差滤色片,9 不同用途的显微镜 及其观察效果,实体观察解剖、大样品（体视显微镜） 培养组织观察倒置显微镜 明场观察常规染色片（HE染色等） 暗场观察微粒外观（细菌记数等） 相差观察活细胞标本（细胞培养、膜片钳等） 偏光观察双折射物质（晶体检测） DIC观察活细胞等（细胞培养，显微操作等） 荧光观察物质鉴定（抗体、抗原、荧光原位杂交等）,体视显微镜,罂粟花蕾（20X）,倒置显微镜 用于细胞培养、组织培养、微生物培养等培养观察中实时观察,原理丁达尔现象微粒发光 结构特点,暗视野显微镜,优缺点可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构 应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。,人血细胞,小花柳叶菜种子,微分干涉相差显微镜(DIC),无色透明活体标本的细微结构 图象呈浮雕状的立体感 观察效果更加逼真,拟南芥根,轮虫,落射正置荧光显微镜的构造,吸收滤色镜,激发滤色镜,分色镜,汞灯,落射正置荧光显微镜的构造,
