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1、基因重组与基因工程 Genetic Recombination & Genetic Engineering,PauI Berg (保罗.伯格) 1973年发明 重组DNA技术 荣获1980年 诺贝尔化学奖,台湾动物科技研究所 2003年,中山大学实验动物中心 陈系古教授,2000年法国科学家，兔子“Alba”,著译者: 黄培堂 出版者：科学出版社 出版时间：2002.09 原著：J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔 定价：￥168.00 字数：2917千字 页数：1949页,中译本序/译者的话/第三版前言 上册 第1章 质粒及其在分子克隆中的应用 第2章 噬菌体及其载体 第3章 M13噬菌体载体 第4
2、章 高容量载体的应用 第5章 DNA凝胶电泳和脉冲场琼脂糖凝胶电泳 第6章 真核基因组DNA的制备和分析 第7章 真核mRNA的提取、纯化和分析 第8章 聚合酶链式反应体外扩增DNA 第9章 放射性标记DNA探针与RNA探针的制备 第10章 合成寡核苷酸探针 第11章 cDNA文库制备及其基因鉴定,下册 第12章 DNA测序 第13章 诱变 第14章 表达文库的筛选 第15章 在大肠杆菌中表达克隆化基因 第16章 哺乳动物培养细胞中导入克隆化基因 第17章 哺乳动物培养细胞的基因表达分析 第18章 蛋白质相互作用研究技术 附录1 分子克隆中使用的缓冲液和试剂的配制 附录2 培养基 附录3 载体
3、和细菌菌株 附录4 分子克隆所用的酶 附录5 酶的抑制物 附录6 核酸 附录7 密码子和氨基酸 附录8 分子克隆中的常用技术 附录9 检测系统 附录10 DNA陈列技术 附录11 生物信息学 附录12 告戒 附录13 供应商 附录14 商标 索引,引言 第一节 基因工程的基本程序 第二节 基因工程常用的工具酶 第三节 基因工程常用的载体 第四节 基因工程在医学和制药工业中的应用,目的要求：1. 掌握重组DNA和基因工程的基本概念；2. 掌握基因工程的基本程序;3. 熟悉基因工程在医学和制药工业中的应用；4. 了解基因工程常用的工具酶和载体。,21世纪核心的科学技术：现代生物技术(生物工程)计算
4、器微电子技术新材料新能源航天技术 现代生物技术：基因工程（核心技术）蛋白质工程酶工程细胞工程,引 言,分子克隆(molecular cloning) DNA克隆(DNA cloning) 基因克隆(gene cloning) 重组DNA(recombinant DNA) 分子克隆技术(molecular cloning technique) DNA克隆技术(DNA cloning technique) 基因克隆技术(gene cloning technique) 重组DNA技术(recombinant DNA technique) 基因工程(gene engineering),引 言,重组DN
5、A(recombinant DNA) ：就是对不同生物的遗传物质目的基因，在体外使用一种工具酶，用人工的方法，进行“剪切”、“组合”、“拼接”，使遗传物质按照我们的意愿重新组合，然后通过运载物质（质粒、噬菌体、病毒等）转入微生物体内或动、植物细胞内（统称载体），进行无性繁殖，并使我们需要的基因在细胞中表达出来，产生出我们所需要的产物或组成新的生物类型。,引 言,重组DNA是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。,基因工程(gene engineering):是指重组DNA的产业
6、化设计与应用，包括上游和下游两大组成部分。上游部分指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA）；而下游部分则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 实现重组DNA所采用的方法及相关的工艺统称基因工程。,理论基础：,不同基因具有相同的物质基础； 基因是可切割的； 基因是可以转移的； 多肽和基因之间存在对应关系； 遗传密码是通用的； 基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。,历史：1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界 上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用 1985
7、第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼,1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计 划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息,胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体,体内-体外,第一节 基因工程的基本程序,获得目的基因和载体； 目的基因和载体的连接(体外重组)；
8、连接产物(重组体)导入宿主细胞； 重组体的扩增、筛选； 目的基因在细胞中的表达、分离、纯化、鉴定等。,载体,目的片断,酶 切,酶 切,重组体,连接,导入细胞,筛 选,扩增、表 达、纯化等,获得目的基因和载体切 目的基因和载体的连接(体外重组)接 连接产物(重组体)导入宿主细胞转 重组体的扩增、筛选筛 目的基因在细胞的表达、分离、纯化、鉴定等。,一、目的基因的获得,1、化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。局限性：短片段、简并性、高费用,2、基因组DNA文库(genomic DNA library)存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。,组织或细胞染色
9、体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,3、cDNA文库：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库(cDNA library)。,组织或培养细胞,载 体,mRNA,cDNA,cDNA与载体连接,导入大肠杆菌,鉴定cDNA文库的克隆数与特征,4、PCR方法获取：,二、重组DNA导入受体细胞,感受态：指受体(或者宿主)处于最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。,将宿主菌在LB平板上划线，37培养16-20h。 挑取单菌落转入20ml LB培养基锥瓶中
10、，37振荡过夜。 从中取2ml菌液转入50ml LB培养基中37振荡培养4-5h， 测OD600达0.4-0.5。 培养物于冰上10min。 转入50ml离心管，于4000rpm下4离心10min。 弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余残液然后加入10ml冰预冷的 0. 1M CaCl2，置冰上10min。 4000rpm 4离心10min，弃上清。 加入2ml，0.1M CaCl2悬浮细胞，于4过夜。,# 感受态细胞制备,转化(transformation)：在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新遗传特性的一种方法。 转染(transfec
11、tion) :指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。,感染(infection) :以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。 转导(transduction) :指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。,1. 重组体导入大肠杆菌（1）氯化钙法（2）电穿孔法(electroporation)（3）病毒感染法/体外包装法,# 氯化钙转化法,在1.5ml Eppendorf管中加入200 l感受态细胞和10l 40ng
12、DNA溶液， 温和混匀，于冰上30min。 于42水浴90S。 冰浴2min。 加入800l LB液体培养基37 45min。 取200l涂布于含Amp(50g/ml)琼脂糖平皿，37培养12-16h，观察结果。,# 电穿孔法,DNA Movement,2. 重组体导入哺乳动物细胞（1）磷酸钙共沉淀法（2）脂质体介导法：人工细胞膜（3）病毒感染法（4）显微注射法,三、 DNA重组体的筛选与鉴定,1. 根据重组载体的表型进行筛选,普通抗菌素平板筛选：插入失活筛选：,-互补蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)产生蓝色，
13、从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。,IPTG; X-gal(5- 溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷),2. DNA限制酶切图谱分析,bp 1534 994 695 515 377 237,A B C M,3. PCR鉴定,4. 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定, 基因工程的基本程序,获得目的基因和载体切 目的基因和载体的连接(体外重组)接 连接产物(重组体)导入宿主细胞转 重组体的扩增、筛选筛 目的基因在细胞的表达、分离、纯化、鉴定等。,基因工程技术策略,分： 基因载体 目的基因质粒 噬菌体 病毒 直接分离 cDNA 人工合成 基因文库切： 限制性内切酶有缺口的载体 目的基因接： 连接酶粘端连接 平端连接 尾接法重组体转： 转化 转染 体外包装带重组体的宿主筛： 表型筛选 电泳法 核酸杂交,第二节 基因工程常用的工具酶,一、限制性核酸内切酶,概念：是由细菌产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸链中磷酸二酯键的核酸内切酶，又叫切割酶或限制酶。 分类：、型。以型为主。 命名原则：,常用限制性内切酶的种类：,# 识别和切割位点：5粘性末端：5-GAATTC-3 5-G AATTC-33-CTTAAG-5 3-CTTAA G-53粘性末端：平端或钝端：,
