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1、结核分枝杆菌mRNA定量检测作为化疗监测指标的研究,结核病是除AIDS外引起死亡最高的感染性疾病，是严重的全球性健康问题之一。 结核病的化学治疗是人类控制结核病的主要手段，成功化疗是患者治愈和限制TB传播的重要措施。 由于宿主体内不同生长菌群的存在以及机体本身对药物作用的反应性不同，有必要对结核病患者制定个体化的化疗方案及其疗效的早期、及时监控。这对确认化疗方案的合理性、及时修正化疗方案，对保证结核病化疗成功和阻断结核病传播至关重要。,目前，通常采用的化疗疗效监测手段是 涂片法和培养法 涂片法敏感性低、特异性差、死活菌不分 培养法受TB生长缓慢的制约，需时长 它们都难当早期预示疗效的重任,mR
2、NA是活菌存在的标志，以mRNA为靶点的扩增方法是TB活菌检测的有效方法 本研究将mRNA体外扩增法应用于接受化疗的结核病患者的痰标本的系列检测中 85B蛋白是TB在液体培养基和巨噬细胞系统中最丰富表达的蛋白之一，在体内也能够表达，大多数肺结核患者显示存在85B蛋白的抗体。所以肺结核患者活跃增殖期的TB细胞内存在丰富的85B mRNA分子 本研究应用定量RT-PCR的方法对肺结核患者痰标本中TB的85BmRNA分子进行检测，并与培养法作比较。以评价mRNA作为化疗监控指标的可行性和临床价值,方 法,病例选择,经痰镜检抗酸菌阳性及胸片证实肺内有活动性病变的初治肺结核患者。 年龄1868岁，体重4
3、0kg以上，非孕妇， 无重要心、肝、肾疾病，无其他重要合并症（如糖尿病、尘肺、精神病等）。,治疗方案,采用标准的短程化疗方案：前2个月每日应用INH(0.3g/d)，RRP(体重50kg者0.45g/d,50kg者0.6g/d)，EMB(体重55kg者0.75g/d，55kg者1.0g/d)和PZA(1.5g/d)，后4个月每日应用INH和RFP。,痰标本的收集及前处理,每位患者治疗前（0d）留取痰标本3份，治疗开始后的2 d、4 d、7 d、14 d、30 d、60 d各留取清晨深咳痰2份。每份痰标本在留取后的24h内进行前处理。 前处理方法：痰标本中加入1ml浓度为2.5%的NALC，NA
4、LC溶解于磷酸缓冲液中(PB)（67mM，pH6.8），转入含有4mm玻璃珠的试管中振荡。匀浆后的痰标本各留取0.5ml于70保存待RNA提取用。,涂 片,取前处理后的痰标本0.5 ml至1.5 ml离心管加入等量的4%NaOH混匀后 ，室温放置10分钟15000g离心5分钟，去上清沉渣中加PBS缓冲液1 ml打匀，15000g离心5 分钟再重复洗1次 ， 溶于0.5 mlPBS中取0.1 ml置载玻片上染色镜检,培 养,取处理后标本0.1 ml 系列10倍稀释后，分别接种到改良罗氏培 养基斜面上每一稀释度 接种2支 置37培养 24h、72h、1周、2周、4周、8周分别观察 生长情况 以8周
5、生长为准计 算菌落数目（CFU）,mRNA定量检测,所有涉及RNA的操作在冰浴中进行 所用的玻璃器皿经200干烤过夜 所有塑料材料用0.1%DEPC水37浸泡2h灭菌双蒸水漂洗后，121高压30min。 整个操作过程中戴手套和帽子，并经常更换手套以免RNA酶污染。,总RNA提取及纯化,0.5 ml标本加入TRIzol-LS 1.0 ml 转入含有玻璃粉的试管中 振荡 静止5min后加氯仿0.2 ml 振荡1min 12000g离心15min 取上层水相 酚/氯仿（5:1）氯仿/异戊醇（24：1）抽提 加入糖原10 g/ml 0.5 ml异丙醇沉淀RNA -20 30min DEPC水配置的75
6、%乙醇洗1次 自然干燥10min 溶于30l DEPC水中,总RNA提取及纯化,总RNA5l 加DNaseI 1l 室温温育 15min 加 1l EDTA 6515min灭活DNaseI 冰上1min 离心收集 直接用于逆转录反应,RT反应,上述总RNA中加入1l dNTP（10mmol/L each ）1l随机引物(Prommega) 70温育5min 立刻置冰上5min 后加入1l MMLV轻弹混合 瞬间离心25 10min 42 50min温育 95 5min终止反应,定量PCR,定量PCR反应在 ABI公司PE5700自动荧光定量PCR仪上进行。 标准曲线的制作：将已知数量的牛分枝杆
7、菌DNA（85BDNA在牛分枝杆菌基因组中均是单拷贝存在）稀释成浓度为：108拷贝/ml、107 拷贝/ml、106 拷贝/ml、105 拷贝/ml 、104 拷贝/ml，各取5l进行PCR反应，根据荧光反应的各自循环阈值（Ct）制作标准曲线。,定量PCR,正向引物序列: 5 CGCGACATCAAGGTTCAGTTC 3反向引物序列: 5 AGGCCGTCGAGCAGATAAAC 3扩增片段长度68bp探针序列：FAM-CGGTGGGAACAACT-MGB均由上海基康生物有限公司合成 反应体系50l, 包括：10mmol/L Tris-Hcl (pH:8.3) , 50mmol/L Kcl,
8、 1.5mmol/L MgCl2, 200nmol/L引物, 250nmol/L探针，200nmol/L dNTP, 1UTaq酶(Prommega公司产),DNA（cDNA）5l。 反应参数：95预变性5min，94变性30s，60复性30s，40个循环。,定量PCR,结果判定标准：扩增结束后，在PE5700定量PCR仪上分析，设定基线范围是610，基线值是0. 1，得到标准曲线及相关系数（r）值,若 r在0.97以上，视为本次实验标准曲线可行，判断检测样品的扩增图形呈S形为阳性后，再读出扩增片段（cDNA）的拷贝数。每毫升痰标本中mRNA拷贝数/ml是cDNA的拷贝数乘以用于RT、PCR及
9、痰标本前处理时的稀释倍数。,其他观察指标,治疗前及在治疗2月后做药物敏感性实验。 治疗前、治疗2个月摄胸片，以断层片证实空洞是否存在。,结 果,入选病例情况男性：9例，（60%），女性：6例（40%）,共15例。平均年龄：34.1313.75岁（范围：1960岁）。其中11例（73.33%）有空洞性病变。15例患者治疗前均对异烟肼、利福平、乙胺丁醇敏感，无1例耐药，治疗2月后亦未出现耐药病例。,治疗过程中痰涂片检查情况,15例患者的痰涂片检查在治疗前是(+）（+），治疗的前14d基本无明显变化，无阴转病例，治疗30d时阴转9例，治疗60d阴转12例，60d的阴转率是80%。,痰标本结核分枝杆菌
10、CFU结果15例患者痰标本的CFU在治疗的2d与治疗前相比平均下降了0.73log10（下降了81%，)，治疗4d平均下降了1.41 log10，前4d的日平均下降速率是：0.35 log10，治疗7d时平均下降了2.21 log10，1例阴转，治疗14d平均下降了3.5 log10，4例培养阴性，治疗30d时培养阴转10例（阴转率为66.67%），治疗60d时15例患者全部培养阴性，60d的培养阴转率为100%。,痰标本85BmRNA检测结果85BmRNA在治疗开始后的2d下降明显，平均下降2.29log10,（下降了99%，）与CFU的下降基本一致。治疗7d85BmRNA检测结果为阴性的1
11、1例（73.33%）,治疗14d85BmRNA检测为阴性的是12例（80%）,在治疗30d除1例为阳性外，其余均为阴性。治疗60d 85BmRNA检测均为阴性。,15例肺结核患者化疗期间痰标本活菌计数结果 (log) (CFU/ml),15例肺结核患者化疗期间痰标本85BmRNA检测结果,讨 论,结核病是TB引起的传染性疾病，具有病程延绵和复发的特点。结核病的化疗是治疗结核病和阻断结核病传播的主要手段。结核病的化疗以杀灭组织内感染的结核分枝杆菌为直接目的，结核病化疗最成功的标准是病变的无菌化。 一个理想的化疗监控方法应该是可以检测宿主内结核分枝杆菌全部菌群在化疗过程的变化，并对化疗方案的结果有
12、早期预示和最终评价的作用。,在过去的20多年，对化疗监测方法的研究进展甚微。X线的改变常常滞后于临床指征的改善，不适合作监测指标。多种血清学的指标能反映病变的活动性，但它们的临床应用价值还未能得到确认。最常用的监测手段是结核病患者痰标本中TB的消失，即几十年来人们一直沿用的细菌学方法。涂片的敏感性依赖于患者的病变程度、操作者的技术等等，一般在2280%，特异性受到其他非结核分枝杆菌和死菌的限制。痰培养法在灵敏度和特异度上优于镜检法，但由于受TB生长缓慢的制约，12个月才能报告结果，难以满足早期监测的目的。,A,B,寻找化疗反应监测以及能预示化疗最终疗效的方法是相当复杂的。抗结核治疗的最终效果受
13、到很多因素的影响：宿主的免疫状态、患者的依从性、药物的生物利用度、药物敏感性、感染的程度等等。所以评估一个患者对抗结核治疗的反应是复杂的、困难的。,以DNA和rRNA为靶点的分子标记物的检测由于存在长度不等的平台期，不能作为化疗监测的指标。根据结核化疗反应的目的和特殊要求，我们在前期工作的基础上，进行了患者痰标本中结核分枝杆菌mRNA分子的检测实验，以寻找化疗的监测方法。,实验结果显示：15例患者痰标本中TB 85BmRNA 在治疗的2d快速下降，12例（73.33%）在治疗14d转阴，治疗30d时仅1例为阳性，60d时检测结果全部为阴性，表明：mRNA分子是与活性结核分枝杆菌的存在直接相关，
14、是活菌数量快速下降的反映，是对化疗药物治疗有效的反映。,将定量RT-PCR方法应用于接受治疗的肺结核患者痰标本中TB的检测关键在于标本的收集与处理方法，RNA的提取质量以及荧光定量PCR的采用等等。患者痰标本中TBmRNA的早期、快速的化疗反应评估对化疗方案的及时修正非常重要尤其在耐药结核病日趋增加的情况下。抗结核治疗需要新药，抗结核新药的临床评价因抗结核治疗的疗程长，而需时较长，TBmRNA在患者痰标本中的快速消失，用于新药、新化疗方案的快速评价将大大缩短实验周期，很有实用意义。,本实验15例患者痰标本中TB85BmRNA在治疗的2d下降了99%（ 2.29log10），CFU下降了81%（
15、0.73log10）,与治疗前相比，均有统计学显著性差异。反映活菌数的快速下降。85BmRNA的下降较CFU明显，可能与利福平直接作用在RNA聚合酶，阻断mRNA的合成， 85BmRNA的半衰期仅23min，便可快速反应在mRNA分子表达水平上以及mRNA扩增法的检测限有关。,早期杀菌作用（EBA）即指抗结核药物治疗最初2d活菌数的下降速率，反映药物对快速代谢复制期的TB的杀灭作用与药物的灭菌作用及治疗的最终结果没有相关性，不能预示最终疗效。但在新药的开发研究中，EBA是反映抗结核新药活性及剂量范围的重要指标。EBA的测定多采用活菌计数的方法，从实验结果分析，mRNA方法的进一步完善有望作为E
16、BA的替代方法。,Desjardin等研究发现TB细胞mRNA分子的拷贝数较少，纯培养物可检测到约5个85BmRNA分子/细菌，而临床标本只检测到约0.1个85BmRNA分子/细菌。 我们的基础实验表明85BmRNA的检测敏感性的限度是103104CFU/ml。 85BmRNA检测阴性的痰标本的菌负荷大多在103CFU/ml以下，所以85BmRNA在治疗60d全部阴转是在本检测灵敏度范围内的。,Mitchison指出：成功化疗的最重要标准是以痰菌阴转为表现的活动性病变的组织灭菌。TB85BmRNA在治疗期间何时的阴转应该可以作为成功化疗的标志，因本研究中例数较少还不能确定，有待进一步扩大研究。多项临床试验表明：治疗2个月的痰培养结果与治疗结束后2年内的复发情况直接相关，治疗2个月的痰培养阳性率高则治疗结束后2年内的复发率也高。本实验中15例患者的85BmRNA30d时仅1例未阴转60d全部阴转，mRNA阴转情况和复发的关系还需继续进行扩大病例数的临床观察,
