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1、赵彦鼎赵彦鼎层析工艺在血浆蛋白纯化中的应用层析工艺在血浆蛋白纯化中的应用(公司内部交流学习)(公司内部交流学习)西安交大保赛生物技术股份有限公司西安交大保赛生物技术股份有限公司2008年年4月月8日日?概述概述?层析工艺应用于不同血浆蛋白的纯化层析工艺应用于不同血浆蛋白的纯化白蛋白白蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白凝血因子凝血因子纤维蛋白胶纤维蛋白胶纤维结合蛋白纤维结合蛋白凝血酶凝血酶抗凝血酶抗凝血酶内容内容概述概述血液制品主要指以健康人血液为原料采用生物学工艺或分离纯化技术制备的生物活性制剂。血液制品主要指以健康人血液为原料采用生物学工艺或分离纯化技术制备的生物活性制剂。血液制品的制备方法有Cohn
2、氏低温乙醇沉淀法离心法及压滤法层析法等。其中，应用最多的是40年代发展起来的Cohn法以及改良法。随着生物技术的发展以及市场对产品多元化及产品质量要求的不断提高，其它的分离手段如层析方法，逐渐在纯化工艺中得到了广泛应用。血液制品的制备方法有Cohn氏低温乙醇沉淀法离心法及压滤法层析法等。其中，应用最多的是40年代发展起来的Cohn法以及改良法。随着生物技术的发展以及市场对产品多元化及产品质量要求的不断提高，其它的分离手段如层析方法，逐渐在纯化工艺中得到了广泛应用。血液中主要蛋白及临床功能如下：血液中主要蛋白及临床功能如下：白蛋白的纯化白蛋白的纯化血浆白蛋白的分离与应用，始于上世纪40年代，由c
3、ohn等人所建立的低温乙醇沉淀法。低温乙醇沉淀法是基于血浆蛋白组分在乙醇溶液中溶解度的差异而实现分离的。该方法作为一项经典分离技术，虽然有较大的局限性，但其程序简单、溶剂价廉，适于工业生产，并能有效保持蛋白的活性，所以曾几经改进，仍被广泛应用。血浆白蛋白的分离与应用，始于上世纪40年代，由cohn等人所建立的低温乙醇沉淀法。低温乙醇沉淀法是基于血浆蛋白组分在乙醇溶液中溶解度的差异而实现分离的。该方法作为一项经典分离技术，虽然有较大的局限性，但其程序简单、溶剂价廉，适于工业生产，并能有效保持蛋白的活性，所以曾几经改进，仍被广泛应用。名称名称分子量分子量(KD)等电点等电点正常含量正常含量(mg/
4、dl)4.6白蛋白（白蛋白（Albumin）6635005500白蛋白纯化工艺（国内企业）白蛋白纯化工艺（国内企业）血 浆血 浆 PH：7.07.2，乙醇加至，乙醇加至8% 温度：温度：-1.5-2.0。离心。离心组分上清液组分上清液组分沉淀组分沉淀 PH：6.97.0，乙醇加至，乙醇加至25% 温度：温度：-4-5。离心。离心组分组分+上清夜上清夜组分组分+沉淀 （制备静丙）沉淀 （制备静丙）PH：6.0，乙醇加至，乙醇加至40% 温度：温度：-4-5。离心。离心组分上清液组分上清液组分沉淀组分沉淀PH：4.5，补加醋酸溶液，乙醇至，补加醋酸溶液，乙醇至40% 温度：温度：-7-9，离心，离
5、心组分沉淀组分沉淀组分组分上清液上清液注射用水溶解，注射用水溶解，PH：4.5。乙醇加至。乙醇加至12%，温度：，温度：-2- 3，过滤。，过滤。澄清过滤，超滤浓缩澄清过滤，超滤浓缩纯化液纯化液白蛋白原液白蛋白原液 调整蛋白质调整蛋白质20%，调整钠离子为，调整钠离子为150mmol/L，调整辛酸钠浓度为，调整辛酸钠浓度为0.165 mmol/g 蛋白，蛋白，PH：6.47.4 半成品半成品 巴氏灭活；除菌分装；巴氏灭活；除菌分装；30孵放孵放14天；一次灯检。 全检；二次灯检。天；一次灯检。 全检；二次灯检。 白蛋白成品白蛋白成品澄清过滤澄清过滤滤液滤液白蛋白纯化工艺（马其顿）白蛋白纯化工艺
6、（马其顿）人血浆人血浆SephadexG-25C脱盐脱盐优球蛋白沉淀优球蛋白沉淀DEAE Sepharose FFCM Sepharose FF55-57热处理热处理sephacryl S-20060 10小时小时白蛋白白蛋白用此法生产的白蛋白纯度超过98%， 而且没有多聚体，二聚体1.5%，前激肽释放酶原激活剂（PKA）低于10IU/ml（过高引起降压反应），铝离子含量也少于20g/L，内毒素55的条件下，凝血酶分子带负 电，因此可用阴离子交换剂对其进行纯化，但文献多见使用葡聚糖及纤维素介质，如 下：前面提到凝血酶的等电点在5055。在pH55的条件下，凝血酶分子带负 电，因此可用阴离子交换
7、剂对其进行纯化，但文献多见使用葡聚糖及纤维素介质，如 下：辛春艳等利用DEAE一52离子交换层析纯化、等电点沉淀法制备的粗凝血酶，所得凝血酶的比活为6431NIHUmg， 得率为2058NIHUL。许长法等利用DEAE一纤维素柱和磷酸纤维素柱分离纯化粗凝血酶液。粗酶液先用DEAE一纤维素柱分离，再用磷酸纤维素柱纯化，再经SephadexG一100凝胶过滤，得到凝血酶电泳纯，比活力为1610NIHUmg，酶活力回收率为481。肖丽霞等用DEAE纤维素(DE32)柱层析和SephadexG一100分子筛层析从猪血浆中纯化得到猪凝血酶，酶比活力为2000Umg，纯化倍数为100，酶活力回收为56。辛
8、春艳等利用DEAE一52离子交换层析纯化、等电点沉淀法制备的粗凝血酶，所得凝血酶的比活为6431NIHUmg， 得率为2058NIHUL。许长法等利用DEAE一纤维素柱和磷酸纤维素柱分离纯化粗凝血酶液。粗酶液先用DEAE一纤维素柱分离，再用磷酸纤维素柱纯化，再经SephadexG一100凝胶过滤，得到凝血酶电泳纯，比活力为1610NIHUmg，酶活力回收率为481。肖丽霞等用DEAE纤维素(DE32)柱层析和SephadexG一100分子筛层析从猪血浆中纯化得到猪凝血酶，酶比活力为2000Umg，纯化倍数为100，酶活力回收为56。亲和层析：亲和层析：凝血酶与低分子量肝素之间有特异性的作用。利
9、用它们之间的特异性亲和作用， 可以将低分子量肝素固定载体上，对凝血酶进行亲和层析纯化。据现有的报道，该法 用于凝血酶分离纯化，使用的亲和载体有壳聚糖、琼脂糖4B、Sepharose CL一6B；凝血酶与低分子量肝素之间有特异性的作用。利用它们之间的特异性亲和作用， 可以将低分子量肝素固定载体上，对凝血酶进行亲和层析纯化。据现有的报道，该法 用于凝血酶分离纯化，使用的亲和载体有壳聚糖、琼脂糖4B、Sepharose CL一6B；王海亭等利用Sepharose CL一6B 作为亲和载体，溴化氰活化后结肝 素制得亲和层析介质，对猪凝血酶 粗酶进行纯化。使其比活提高了 325倍，回收率为506（色谱
10、图如下）。王海亭等利用Sepharose CL一6B 作为亲和载体，溴化氰活化后结肝 素制得亲和层析介质，对猪凝血酶 粗酶进行纯化。使其比活提高了 325倍，回收率为506（色谱 图如下）。肖丽霞等作了壳聚糖和琼脂糖4B 两种不同的亲和吸附剂地猪凝血 酶分离纯化效果的比较（结果如 右）。肖丽霞等作了壳聚糖和琼脂糖4B 两种不同的亲和吸附剂地猪凝血 酶分离纯化效果的比较（结果如 右）。纤维结合蛋白（Fibronectin,Fn）纤维结合蛋白（Fibronectin,Fn）Fn 是存在于细胞表面和血浆中的高分子糖蛋白。血浆Fn是二聚体，两个亚基在C末端附近通过半胱氨酸残基籍二硫键相连。细胞性Fn以
11、二聚体或多聚体形式存在于许多细胞表面。Fn在治疗疱疹性角膜炎所致的角膜溃疡疱疹及外伤性角膜糜烂糖尿病、患者晶状体摘除后角膜上皮损伤等角膜病有显著疗效。Fn 是存在于细胞表面和血浆中的高分子糖蛋白。血浆Fn是二聚体，两个亚基在C末端附近通过半胱氨酸残基籍二硫键相连。细胞性Fn以二聚体或多聚体形式存在于许多细胞表面。Fn在治疗疱疹性角膜炎所致的角膜溃疡疱疹及外伤性角膜糜烂糖尿病、患者晶状体摘除后角膜上皮损伤等角膜病有显著疗效。经研究，Fn分子有和明胶、肝素、纤维蛋白结合的区域，采用Gelatin SepharoseHeparin Sepharose 亲和层析法可以从血浆或冷沉淀中提取纯化Fn，当然
12、还需要加入病毒灭活步骤。经研究，Fn分子有和明胶、肝素、纤维蛋白结合的区域，采用Gelatin SepharoseHeparin Sepharose 亲和层析法可以从血浆或冷沉淀中提取纯化Fn，当然还需要加入病毒灭活步骤。抗凝血酶III (AT-III)抗凝血酶III (AT-III)肝素是一种带负电荷的多聚物,是AT-的辅因子,又是许多凝血因子的抑制剂,因此通过静电和亲和相互作用可分离血浆中的很多因子。肝素是一种带负电荷的多聚物,是AT-的辅因子,又是许多凝血因子的抑制剂,因此通过静电和亲和相互作用可分离血浆中的很多因子。第一个用亲和层析技术从血浆中分离成功的蛋白是AT-。AT-最初主要是通
13、过氢氧化铝或磷酸钙等的吸附来制备,不仅费时费力,收率低,且只得到半纯品(Abildgaard,1968)。1974年,Miller.Andersson等首次以heparin-Sepharose 4B亲和层析纯化了AT-,为以后的大规模制备奠定了基础。之后的分离都是以肝素亲和层析为核心,辅以其他蛋白纯化技术,得到纯度、活性均较高的AT-制品。第一个用亲和层析技术从血浆中分离成功的蛋白是AT-。AT-最初主要是通过氢氧化铝或磷酸钙等的吸附来制备,不仅费时费力,收率低,且只得到半纯品(Abildgaard,1968)。1974年,Miller.Andersson等首次以heparin-Sepharo
14、se 4B亲和层析纯化了AT-,为以后的大规模制备奠定了基础。之后的分离都是以肝素亲和层析为核心,辅以其他蛋白纯化技术,得到纯度、活性均较高的AT-制品。AT-III被用于治疗先天性或后天性AT-III 缺乏症患者，目前普遍采用Heparin SepharoseFF从CohnIV沉淀或去除FIX、FVIII的血浆中提取的方法工艺如下：AT-III被用于治疗先天性或后天性AT-III 缺乏症患者，目前普遍采用Heparin SepharoseFF从CohnIV沉淀或去除FIX、FVIII的血浆中提取的方法工艺如下：名称名称分子量(KD)分子量(KD)等电点等电点正常含量(mg/dl)正常含量(mg/dl)AT-IIIAT-III56563030抗凝血酶III纯化工艺抗凝血酶III纯化工艺抗凝血酶抗凝血酶III纯化工艺纯化工艺(瑞典瑞典) 层析在血浆蛋白分离中的应用（层析在血浆蛋白分离中的应用（T.Burnouf）从上面的实例中可以看出，层析技术可在多数蛋白的分离纯化中得到应用，有些甚至起到别的方法无法替代的作用。从上面的实例中可以看出，层析技术可在多数蛋白的分离纯化中得到应用，有些甚至起到别的方法无法替代的作用。
