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1、微生物的生理生化试验,微生物的生理生化试验,不同的细菌分解利用糖类、脂肪类和蛋白质类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不同，通过检测微生物的不同代谢产物和代谢过程中不同的酶系统，达到鉴定细菌的目的。包括糖类代谢试验、蛋白质代谢试验、碳源和氮源利用试验、呼吸酶类试验以及其他酶类试验。,一、糖类代谢试验,糖类是作为碳源和氮源提供细菌合成菌体成分的必须原料，不同的细菌分解糖类的能力和代谢产物不同，可作为鉴定细菌的依据之一。,一、糖类代谢试验,1、糖类发酵试验 不同细菌含发酵各种糖类的酶不同，分解糖类（糖醇类）的能力亦不同，根据分解不同糖类后产物的差异，来鉴定细菌。 结果：若细菌分解糖类产酸，使
2、培养基中的指示剂显酸性反应，颜色发生变化，若产气可使培养基中的导管或者琼脂出现气泡，无变化则说明阴性。 说明：指示剂：酚红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝（黄红）（黄紫） （黄蓝）部分糖类灭菌需防止高温破坏。,一、糖类代谢试验 1、单糖分解反应： 葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖,一、糖类代谢试验,2、氧化-发酵试验（OF试验） 细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有氧参加的称为氧化型，有氧无氧都可以分解葡萄糖的称为发酵型，不分解葡萄糖的称为产碱型。 方法：穿刺两只斜面琼脂，一只滴加无菌液体石蜡，高度不少于1cm，35培养48小时。 结果：两只均为黄色为发酵型，均不变为产碱型或不分解塘型，不加石蜡的变黄而
3、加石蜡未变黄为氧化型。,一、糖类代谢试验,2、氧化-发酵试验（OF试验）,一、糖类代谢试验,3、甲基红（MR）试验主要用于肠杆菌科内细菌的鉴别。 方法：接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中35培养2-3天，滴加0.04%甲基红酒精溶液观察。 原理以及结果：细菌分解葡萄糖过程中产生丙酮酸进一步代谢为酸类，使PH下降至4.5以下，加入甲基红出现红色（酸性）为阳性反应，黄色（碱性）为阴性反应。橘红色为弱阳性。,一、糖类代谢试验,3、甲基红（MR）试验,一、糖类代谢试验,4、V-P（Voges-Proskauer）试验 目的：常与甲基红试验同时使用，前者阳性的细菌后者常为阴性，反之亦然。可用于大肠杆菌和产气杆
4、菌的区别。 原理：一些细菌代谢产生的丙酮酸脱羧后生成的乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气氧化生成丁二酮，与蛋白胨的精氨酸的胍基反应生成红色化合物。 结果：出现红色为阳性，不出现红色为阴性。,4、V-P（Voges-Proskauer）试验,一、糖类代谢试验,一、糖类代谢试验,5、-半乳糖苷酶试验（ONPG试验） 目的：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验阳性，而不发酵乳糖的细菌（如沙门氏菌）为阴性。 原理：细菌迅速分解乳糖是有-半乳糖苷渗透酶和-半乳糖苷酶，但ONPG分子与乳糖相似且分子较小，故不需-半乳糖苷渗透酶也可分解乳糖。 结果：呈现黄色为阳性反应，通常20-30min内显色 注意：为提高阳
5、性反应速度，需大量接种培养物。 需要适当缓冲，过酸出现假阴性，过碱则出现假阳性。产黄色素细菌不宜做次试验，如必须做可离心后判定结果,一、糖类代谢试验 5、-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）,二、蛋白质代谢试验,不同细菌分解蛋白质能力不同，可利用不 同氮源来合成菌体蛋白质，可通过检测加 入蛋白质分解后的产物或PH变化来鉴定细 菌。,二、蛋白质代谢试验,1、吲哚（indole）试验（又称靛基质试验） 目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。 原理：细菌分解蛋白胨中色氨酸生成的吲哚与试剂中的二甲氨基苯甲醛作用生成红色的玫瑰吲哚。 方法：纯培养物接种蛋白胨水后35培养24-48h沿管壁徐徐加入Kovac氏试剂或欧
6、氏试剂0.5ml观察。 结果：两层液体交界处出现红色为阳性，无色为阴性。,二、蛋白质代谢试验,1、吲哚（indole）试验（又称靛基质试验）,二、蛋白质代谢试验,2、氨基酸脱羧酶试验 目的：通过不同细菌对氨基酸之羧基的分解能力来鉴别细菌。 原理：细菌产生的脱羧酶可脱掉氨基酸之羧基，生成胺和CO2 ，使培养基PH升高，指示剂显色。 常用氨基酸有三种： a、赖氨酸：经过赖氨酸脱羧酶作用生成尸胺和CO2 。 b、鸟氨酸：经过鸟氨酸脱羧酶作用生成腐胺和CO2 。 c、精氨酸：经过精氨酸脱羧酶作用生成精胺和CO2 。,二、蛋白质代谢试验,2、氨基酸脱羧酶试验 结果：检测培养基由黄色变紫色为阳性，黄色为阴
7、性，对照（无氨基酸）为黄色。,二、蛋白质代谢试验,3、精氨酸双水解酶 原理：精氨酸经过精氨酸双水解酶两次水解，产生鸟氨酸、两分子氨和一分子CO2 。 沙门氏菌分解精氨酸是由于精氨酸双水解酶，而大肠埃希氏菌则是由于精氨酸脱羧酶。 结果：指示剂颜色转为碱性时为阳性。即酚红转为红色，溴甲酚紫转为紫色。,二、蛋白质代谢试验,4、苯丙氨酸脱氨酶试验 目的：检测细菌的脱氨基能力。该试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。 原理：细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱去氨基生成的苯丙酮酸和加入的FeCl3 ,螯合后出现绿色产物，随后绿色褪去。 结果：将FeCl3 试剂滴于琼脂斜面上，自上流下，5min内判断，出现绿色
8、为阳性。,二、蛋白质代谢试验,4、苯丙氨酸脱氨酶试验,二、蛋白质代谢试验,5、硫化氢试验 目的：检测细菌对含硫化合物的分解能力 原理：细菌分解含硫氨基酸生成硫化氢与培养基中的铁或者铅离子生成黑色化合物。 方法：接种三糖铁琼脂或悬挂醋酸铅试纸。 结果：培养基出现黑色为阳性,二、蛋白质代谢试验,三糖铁（TSI）试验,二、蛋白质代谢试验,6、明胶液化试验 目的：检测细菌能否液化明胶 原理：细菌产生的明胶酶可使明胶分解，由半固态转化为液态。 结果：穿刺接种后培养基不再凝固为阳性。,二、蛋白质代谢试验,7、尿素酶试验 目的：通过检测尿素酶来进行肠杆菌科细菌的鉴定 原理：细菌产生的尿素酶分解尿素产生大量的
9、氨，使培养基PH值升高，用酚红指示剂测出。 结果：培养基变红为阳性，不变为阴性。,二、蛋白质代谢试验,7、尿素酶试验,三、碳源和氮源利用试验,1、柠檬酸盐利用试验 目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。 原理：细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，能在除柠檬酸盐外不含其他碳源的培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。 结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，不变色为阴性。,三、碳源和氮源利用试验,2、丙二酸盐利用试验 目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。 原理：某些细菌将丙二酸盐作为唯一的碳源时，丙二酸盐被分解成为碳酸钠，使培养基变碱性。 结果：培养基变蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。,三、碳源和氮源
10、利用试验,2、丙二酸盐利用试验,三、碳源和氮源利用试验,3、醋酸盐利用试验 目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。 原理：细菌利用铵盐作为唯一氮源同时利用醋酸盐作为唯一碳源时，分解醋酸钠产生二氧化碳和水与钠离子结合生成碳酸钠使培养基呈碱性，指示剂由绿变蓝。 结果：斜面上有菌落生长且培养基变蓝色为阳性。,三、碳源和氮源利用试验,4、马尿酸钠水解试验 目的：用于链球菌的鉴定。 a、FeCl3法：细菌含马尿酸钠水解酶分解马尿酸钠水解生成苯甲酸和FeCl3结合产生苯甲酸铁沉淀。 结果：离心后取上清液加入FeCl310-15min观察出现稳定沉淀物为阳性，轻摇后溶解为阴性。 b、茚三酮法：细菌含马尿酸钠水解酶分
11、解马尿酸钠水解生成的甘氨酸和茚三酮作用生成紫色化合物。结果：马尿酸钠水溶液培养物加入茚三酮后出现紫色为阳性。,四、呼吸酶类试验,1、氧化酶试验 目的：主要用于弧菌科，与肠杆菌科区别。 原理：氧化酶氧化细胞色素C的产物使对苯二胺氧化生成红色的醌类物质。 结果：阳性立即呈现红色或者粉红色，颜色逐渐变深至深紫色。 注意：a、试验过程中避免接触含铁物质以免出现假阳性。b、试剂易氧化，需及时配制。,四、呼吸酶类试验,1、氧化酶试验,四、呼吸酶类试验,2、过氧化氢酶（触酶）试验 目的：用于G+细菌的初步分群，其中链球菌试验阴性，葡萄球菌及微球菌试验阳性。 原理：过氧化氢酶被细菌分解为水和氧。 结果：在挑菌
12、落于玻片或试管内，滴加3%过氧化氢数滴，30s内有大量气泡产生者为阳性，无气泡者为阴性。 注意：必须用新鲜培养物。陈旧培养物会出现假阴性。不宜挑取血琼脂上的菌落，因红细胞内含有触酶，会导致假阳性。,四、呼吸酶类试验,2、过氧化氢酶（触酶）试验,四、呼吸酶类试验,3、硝酸盐还原试验 原理：某些G-细菌在代谢过程中，将硝酸盐还原为亚硝酸盐，与醋酸反应后生成亚硝酸，其与试剂中的对氨基苯磺酸反应生成对重氮苯磺酸，再与-萘胺结合生成红色化合物。 结果：培养后加入试剂于试管内，出现红色为阳性，无颜色变化为阴性。,3、硝酸盐还原试验,四、呼吸酶类试验,五、其他酶类试验,1、卵磷脂酶试验 原理：在培养基中加入
13、含卵磷脂的卵黄液，接种待检菌后出现乳浊环者表示卵磷脂被分解成甘油脂（脂肪），说明细菌产生卵磷脂酶。 结果：划线接种于卵黄琼脂上，培养3h后在菌落周围产生乳白色浑浊环，6h后可扩散至5-6mm。,五、其他酶类试验,2、凝固酶试验 目的：常用于鉴别葡萄球菌。 原理：金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白附着于细菌表面产生凝固。分为与细胞壁结合的凝固酶（玻片法）与菌体生成后释放在培养基中的游离凝固酶（试管法）。 玻片法：在玻片上加生理盐水与血浆个一滴，观察凝集情况 试管法：三只含1：4血浆0.5ml的试管各接种待检菌、阳性菌株和肉汤阴性菌株，待检菌出现凝固且阴性对照不凝固为阳性。,五、其他酶类试验,2、凝固酶试验,五、其他酶类试验,3、DNA酶试验（其一） 原理：DNA酶可水解DNA产生的寡核苷酸链（溶于酸）。在平板上加入盐酸后，在菌落周围可产生透明环。 结果：在平板上加入1mol/L盐酸，周围产生透明环者为阳性，无透明环为阴性,五、其他酶类试验,3、DNA酶试验（其一）,微生物的生理生化试验简介完毕 谢谢！,
