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1、教学目标: 1、掌握生物测定的特点、生物反应类型与熟知减少生物差异性的方法与措施。 2、了解剂量和反应的关系。 3、学习肝素、绒促性素生物检定法,复习旧课:复习生测统计内容；药品生检技术概念与品种。,第三章 药品生物活性检定技术 第一节 概 述,讲授新课：第一节 概 述,生物测定技术的一个主要用途是用于测定理化方法不测定其效份的一部分药品的生物活性，其机理是利用药物的剂量和药理作用在一定范围内存在着量-效关系，即剂量增大，药理作用随着增强。将剂量和反应经过适当数学转换后，量-效关系可以转化为以反应或其函数为纵坐标，剂量或其函数为横坐标的直线关系。这就是生物测定实验设计的基础。,由于生物差异的存
2、在，生物测定结果误差较大，重现性较差，需要控制的条件较多，加上测定费时，计算繁琐。所以，生物测定主要用于无适当理化方法进行检定的药物，补充了理化检验的不足。随着科学技术的发展及新药的不断发现，一些品种的生物测定法可能被理化检验代替，而一些新药的生物测定技术方法又在不断建立，因而生物测定技术总是在不断吸收新技术、新内容而发挥新的作用。,中国药典(2005年版)收载了肝素、绒促性素、胰岛素、缩宫素、硫酸鱼精蛋白、精蛋白锌胰岛素、卵泡刺激素、黄体生成素、降钙素、生长激素、升压素、洋地黄12个品种采用生物测定技术的方法来测定其生物活性（效价）。药品生测必备的实验动物的捉拿与注射方法。,一、生物测定的特
3、点：,1. 生物差异性大,2. 实验误差大 实验结果一般不及理化检验准确，实验误差通常在1020之间。甚至更大。,3. 实验周期长，人力、物力消耗大，计算较繁,二、减少生物差异性的方法与措施,1. 从实践和理论上了解各被试物对所用动物的生物反应差异性的规律,2. 调整样本的大小,3. 对供试用动物进行条件因素的限制,4. 研究各种实验方法的反应类型,5. 用生物统计方法提高实验的可靠性,三、生物反应类型,(一) 量反应 当一定剂量的药物作用于生物体时，所引起的反应是可以计量大小的(观察药物反应的程度，可以用数字来表示其大小)。如器官长度的伸缩、血压的高低、器官重量的增减，抑菌圈直径的大小、凝血
4、时间的长短等。,(二) 质反应 当一定剂量的药物注入动物体内后，观察某一反应或反应的某一程度出现与否(只出现正负反应两种情况，而无程度之别，如死或不死、惊厥或不惊厥)，所引起的反应只有质的变化，即此类反应只可计数而不能用定量的方法表示个体反应程度。不少药物可选用不同类型的反应指标来进行生物测定。如胰岛素效价测定可以选用小鼠惊厥法，又可选用血糖降低法等；,在选用反应指标时，应考虑反应的专属性及检定结果的精密度，一般要注意以下几点：,(1) 同质反应的剂量范围要宽 生物测定必须在同质反应基础上进行，而药物同质反应一般都有一定的剂量范围，超出了一定的剂量范围，反应性质可能发生变化。,(2) 同剂量各
5、次反应的差异要小 即指标的重现性要好，此时检定结果才比较可靠。,(3) 反应程度随剂量的变化要有显著改变。 (4) 剂量与反应的关系可用适当的数学式表示。,四、剂量和反应的关系,生物测定是利用药物不同剂量引起生物体反应程度的变化以进行药物效价测定的，要计算效价，首先要研究剂量和反应之间的关系。许多药物在相当宽的剂量范围里，剂量和反应之间存在着一定的规律性，并可用一定的数学公式表示，研究剂量和反应关系，基本内容就是找出这个规律，并采用坐标转换的方法解决曲线转换为直线的问题，以便用最简单的方法进行统计处理。通常以剂量作横坐标，反应为纵坐标，在方格纸上划点连线，由所成的剂量反应曲线形状推断剂量或反应
6、应作何种函数转换,直至剂量反应线在一定范围内成直线。剂量反应线的斜率对检定结果有重要意义，斜率越大，表明反应对剂量变化越敏感，实验结果就越精密可靠。,由于生物差异及测定误差的存在，剂量和反应的数学关系只是一个粗略的近似关系，二者仅在实验数据范围内才可靠，不可用外推法去估计实验结果，否则将得出错误的结论。,量反应中剂量与反应的关系,(1) 对数剂量与反应成直线关系 在一定剂量范围里，很多量反应与剂量的关系是一条先锐后钝的曲线，很象对数曲线，此时如将计量转换为对数剂量，即可成一直线。(2) 对数剂量与对数反应呈直线关系 大部分“时”反应中，剂量反应曲线为先钝后锐的曲线，当将剂量和反应均转换为对数后
7、，曲线转化为直线。属于这一类型的有肝素家兔全血法等。,(3) 坐标转换的其他方法 将反应值转换为平方根或立方根，这种转换也能不平衡地缩小反应值，缩小作用与对数最强，立方根次之，平方根最弱，因此开方转换适用于幅度较小的曲线；属于这种转换的有促皮质素小鼠胸腺法等。 有时可将反应转换为倒数（1y），使曲线直化，常用于时反应。 对数坐标轴的上、下、左、右移动，本法适用于经对数转换后，起点部分仍有弯曲的情况，移动距离应试探后确定。,第三节 肝素生物测定技术,肝素系由健康牛、猪、羊等食用动物的肺、肝、肠粘膜中提取的一种粘多糖。肝素的主要药理作用为抗凝血作用，能延长凝血时间。分子量为600020000。肝素
8、的效价测定方法虽有化学检验法，紫外分光光度法等，因测得的效价常常不能和生物效价一致，因此仍以生物测定为主。其原理是根据肝素具抗血凝的药理作用，同时在体外也有抗凝血作用而建立的。中国药典(1977)用新鲜兔血量反应平行线测定,1985、1990、1995、2000、2005年版药典除沿用该方法外，又增加兔猪血浆为实验材料。该法是比较肝素标准品(S)与供试品(T)延长兔新鲜血或兔、猪血浆凝结时间的作用，以测定供试品的效价。,一、测定前标准品、供试品与血浆的配制与制备,（一） 标准品溶液的配制 精密称取肝素标准品适量，按标示效价加灭菌水溶解使每ml 含100 U的溶液，分装于适宜的容器内，48贮存，
9、如无沉淀析出，可在3个月内使用。,（二） 标准品稀释液的配制 试验当日，精密量取标准品溶液，按高、中、低剂量组(dS3、dS2、dS1)用0.9氯化钠溶液配制成三种浓度的稀释液，相邻两浓度的比值(r)应相等；调节剂量使低剂量组各管的平均凝结时间较不加肝素对照管组明显延长。高剂量组各管的平均凝结时间，用新鲜兔血者，以不超过60 min为宜，其稀释液一般可配成每ml中含肝素25 U，r为1：0.7左右；用血浆者,以不超过30 min为宜，其稀释液一般可配成每ml中含肝素0.51.5 U，r为1:0.85左右。,（三） 供试品溶液与稀释液的配制 按供试品的标示量或估计效价(AT)，照标准品溶液与稀释
10、液的配制法配成高、中、低(dT3、dT2、dT1)三种浓度的稀释液。相邻两浓度之比值(r)应与标准品相等，供试品与标准品各剂量组的凝结时间应相近。（四） 血浆的制备 迅速收集兔血或猪血置预先放有8枸橼酸钠溶液的容器中，枸橼酸钠溶液与血液容积之比为1：19，边收集边轻轻振摇，混匀，迅速离心约20 min(离心力不超过1500g为宜，g为重力常数)。立即分出血浆，分成若干份分装于适宜容器内，低温冻结贮存。临用时置370.5水浴中融化。用两层纱布或快速滤纸过滤，使用过程中在48放置。,二、测定方法 中国药典规定可用新鲜兔血法与血浆法。,(一) 新鲜兔血 取管径均匀(0.8 cm3.8 cm或1.0
11、cm7.5 cm)、清洁干燥的小试管若干支，每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液0.1 ml，每种浓度不少于3管，各浓度的试管支数相等。取刚抽出的兔血适量，分别注入小试管内，每管0.9 ml，立即混匀，避免产生气泡，并开始计算时间。将小试管置370.5恒温水浴中，从动物取血时起至小试管放入恒温水浴的时间不得超过3 min。注意观察并记录各管的凝血时间。,(二) 血浆 取上述规格的小试管若干支，分别加入血浆一定量。置370.5恒温水浴中预热510 min。依次每管加入一种浓度的标准品或供试品稀释液及1氯化钙溶液(每种浓度不得少于3管，各浓度的试管支数相等)。血浆、肝素、稀释液和氯化钙溶液的加入
12、量分别为0.5、0.4和0.1 ml(或0.8、0.1和0.1 ml)加入氯化钙溶液后，立即混匀，避免产生气泡，并开始计算时间，注意观察并记录各管凝结时间。将各管凝结时间换算成对数，照生物测定统计法中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。检定法1的可信限率(FL)不得大于10。检定法2的可信限率(FL)不得大于5。,三、注意事项(1) 用新鲜兔血检定时，取血要求出血快。出血快慢是实验成败的关键。一般多采用动脉取血。(2) 血液加入预先加有肝素的小试管时，应防止产生气泡。加血后立即用小玻棒混匀，各管搅拌要均一。(3) 加血次序由高剂量到低剂量，且标准品和供试品管要对应加入血液。20管加血顺序如下图3-1。,图3-1 :加血顺序图,(4) 水浴的水面一定要高于试管内的液面，防止出现下边凝结，上边不凝现象。,(5) 终点观察可采用倒转法，即将试管轻轻倾斜90度，血液不流动为终点。开始时，手拿起管子并用手指轻轻弹管壁，即可见液面颤动，此时可隔23 min观察一次，当液面开始凝固，手指轻弹管壁已不太颤动时，每隔1 min观察一次，当手指轻弹管壁几乎不再颤动时，0.5 min观察一次。也可用压板法和测凝棒法。,巩固新课: 生物检定的特点、生物反应类型与减少生物差异性的方法与措施。肝素、绒促性素生物检定法,布置作业: 55（一）、（二）,
