心血管基因治疗

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1、心血管疾病的基因治疗,心血管研究所 黄薇 副教授,电话：82801589，email: (508, 18:40-20:30),第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 临床意义上的基因治疗，是指通过特定的载体，将外源性DNA编码的基因或者 是对特定基因有修饰作用的DNA、RNA，可以直接导入特定的人体器官 或特定部位（In Vivo），也可以先导入到体外培养的细胞中，再将细胞导入 人体(Ex Vivo)，从而起到治疗特定疾病的效应。,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾

2、1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症患者基因治疗成功。 10年后， 在法国9例ADA缺乏症患者接受治疗， 3年后， 3例患淋巴细胞白血病和恶性骨髓瘤。 迄今为止， 1500多个临床方案被实施，累计几万人接受了治疗。,在中国，人们以碳水化合物为主，高甘油三酯血症患者是高胆固醇血症患者的4倍。近来发现高甘油三酯血症可作为心血管疾病的独立发病因子，得到广泛重视和研究。图为脂蛋白脂酶基因缺陷导致的高甘油三酯小鼠，血浆呈牛奶状。,小鼠极度高

3、甘油三酯血症血浆,中国山东病人极度高甘油三酯血症血浆,脂蛋白脂酶LPL缺陷的基因治疗,三、基因治疗的方法 （1）目的基因的制备 （2）靶细胞的选择和培养 （3）载体的选择 （4）导入方法,第一节 基因治疗概论,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,目的基因的制备（基因治疗的策略）,1.基因替代（gene replacement） 针对整个病变基因，不考虑基因上的致病性突变位

4、点，将整个正常基因导入细 胞内，使外源正常基因在体内表达，达到治病的效果。 2.基因修正（gene correction） 针对致病基因的突变碱基序列，设计特殊的修正序列，导入细胞后，将致病基 因的突变位点置换下来，达到治病的效果。 3.基因放大（ gene augmentation) 基因放大通常选择和致病 （缺陷）基因有互补或相近功能的基因，将此基因 导入后高表达，其发挥的功能可以纠正缺陷的病变基因。LDL-R-/- VLDL-R,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA

5、缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,4.基因失活 （gene inactivation） 反义技术（antisense technology） 反义核酸技术就是根据碱基互补原理，利用人工或生物合成特异互补的DNA 或RNA片段抑制或封闭基因表达的技术，包括反义寡核苷酸技术、反义RNA技术和核酶技术。（转录和翻译水平，特异阻断靶基因的表达） 基因敲除技术（gene knock-out）或条件敲除（conditional KO） RNA干扰（RNA interference, gene knock-down） RNA (interf

6、erence，RNAi）是由双链RNA（double stranded RNA,dsRNA） 分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,RNAi示意图,四、基因治疗的方法 （1）目的基因的制备 （2）靶细胞的选择和培养（ex vivo) （3）载体的选择 （4）导入方法,第一节 基因治疗概论,第一节 基因治疗概论,一、基

7、因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,靶细胞的选择和培养 体细胞和生殖细胞,1.体细胞： (1)成纤维细胞： 优点： 容易获取或体外培养，也容易植回体内； 易转染，并能稳定地表达外源目的基因， 合成和分泌的蛋白质可以通过血液供各种类型细胞使用； 回输的成纤维细胞很容易被取出。 (2)造血干细胞： 优点： 取材比较容易，并易于输回体内； 造血干细胞具有不断分裂、分化成各种血细胞的潜能； 基因产物在骨髓细

8、胞成熟后可以通过血液循环遍布全身。 缺点: 骨髓造血干细胞在骨髓细胞中所占比例极少(0.1%)， 提高基因转移效率，提高表达水平及延长表达时间.,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,(3)成肌细胞： 优点：成肌细胞来源于骨骼肌，易获得； 成肌细胞易于体外培养； 成肌细胞具有增殖能力； 易于基因转移，并易与原位肌纤维融合，血管丰富。 (4)血管内皮细胞：导管球囊携带DNA可

9、成功地进行血管基因转移。 (5)淋巴细胞： 优点：易提取，易体外培养并易于回输入体内； 基因转移效率较高。 缺点：回输体内后淋巴细胞的寿命短，需要经常输入.,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,2. 生殖细胞（主要用在动物模型上）： transgenic and knock out animal model,四、基因治疗的方法 （1）目的基因的制备 （2）靶细胞的选择和培

10、养 （3）载体的选择,第一节 基因治疗概论,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,载体的选择,病毒型载体和非病毒型载体,逆转录病毒（retrovirus，RV）载体 优点： RNA反转录为DNA , 感染效率高，并稳定持久地表达所带的外源基因 缺点： 容量小，只能容纳810kb的外源基因片段； 血清补体能使之失活； 病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度； 病毒整合到DNA后

11、，可能引起插入突变和激活癌基因的可能； 宿主范围有限，只感染增殖细胞，故在应用上有一定局限性。,理想载体: 低毒， 高效， 大容量， 可调控的基因转导。,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,2.腺病毒（adenovirus，Ad）载体 线性双链DNA，36Kb 优点：宿主领域广（感染分裂期，非分裂期细胞） 可获得高病毒效价，适用于临床 可直接体内注射 腺病毒颗粒比较稳定

12、插入外源基因容量大 缺点： 免疫原性强，只适用于短期感染（2-3周） 缺乏靶向性 可能有致病性,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,3. 腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体 单链线性DNA，缺陷病毒，动物病毒中最小的。 优点：宿主范围广泛 介导长期的基因表达，最有希望的病毒载体系统之一 插入突变的危险性低，生物安全性高 缺点： 载体容量

13、有限（5 kb），不适于较大基因片段的插入 可用于癌基因治疗，但转染能力不如腺病毒,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,4. 慢病毒（lentivirus，LV）载体 反转录病毒的一种 优点： 既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞 转移基因片段容量较大 目的基因表达时间长 不易诱发免疫反应 缺点：毒力恢复、垂直感染等安全问题,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene t

14、herapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,非病毒载体,原理：非病毒载体主要通过与DNA结合成颗粒复合物，然后将DNA导入细胞进而 转移至细胞核。目前所应用的非病毒载体方法包括裸质粒直接应用、脂质体、阳离子 多聚体(多聚赖氨酸PLL、聚乙烯亚胺PEI）、纳米颗粒载体等。 优点：容量大、操作方便、安全和无免疫源性 缺点：感染效率没有病毒高，高浓度是有细胞毒性，有的在体内不能降解。,四、基因治疗的方法 （1）目的基因的制备 （2）

15、靶细胞的选择和培养 （3）载体的选择 （4）导入方法,第一节 基因治疗概论,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,Ex Vivo，细胞介导的基因治疗，首先将目的基因在体外导入到培养的细胞内，再将细胞移植到机体的特定器官或部位发挥作用（主要是以造血干细胞为主）。 In Vivo，组装了目的基因的载体将直接导入到所需部位，有直接注射，如在肌肉中表达的多点注射；缺血心肌直视下直接

16、注射，静脉注射（肝脏为靶器官），肿瘤部位的注射。,导入方法,第一节 基因治疗概论,一、基因治疗（gene therapy）的定义 是纠正疾病相关的缺陷基因的一种技术。 二、基因治疗的历史回顾 1990年，在美国首例ADA缺乏症患者基因治疗成功。 截止2000年， 400多个临床方案被实施，累计3500多个人接受了治疗。,基因治疗存在的问题及方向,目的基因在宿主体内表达不稳定，时间短，限制了基因治疗的疗效； 目的基因移植引起免疫系统对已识别过的外来物产生免疫增强， 使病人的治疗难以重复； 病毒载体对病人可能有各种潜在的危险； 许多疾病是由多基因紊乱引起，无法用单基因纠正解决问题。 目标：高效性、靶向性、可调控性、安全性，尤其是在表达 时间、部位、水平以及对各种信号反应的可调控性方面能够操控 对单基因遗传病、恶性肿瘤的术后复发和转移、心血管病等，基因治 疗提供了一个全新的治疗思路，为人类攻克这些不治之症带来了希望。,