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1、第二讲 多克隆抗体制备,Polyclone antibody 用常规的方法免疫动物，制备的抗体 一、免疫动物 主要是哺乳动物和禽类，如兔、绵羊、山羊、鼠、马等。动物选择根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。,如需要大量的抗体，则用大动物； 如要获得直接标记诊断的抗体，则用本种动物； 如要获得间接标记诊断的抗体，则用异源动物； 如抗原量少，且难获得，则用纯系小鼠； 一般实验室用抗体，多用兔或鼠。 对于用于诊断的抗体，最好用SPF级动物,通常选年轻、健康的雄性动物，怀孕的雌性动物 一般不用于制备抗体。 二、免疫用抗原 1 抗原的选择依所需抗体而定 2 抗原剂量： 依据动物的种类、免疫周期以
2、及所要求的抗体的 特性等不同而不同。量太低，不能产生强烈的免 疫应答，抗体水平低量太高，则会产生免疫耐受。,一般情况下： 小鼠：50-400ug/次 大鼠：100-1000ug/次 兔： 200-1000ug/次 加强免疫的剂量为首次剂量的1/2,免疫剂量与免疫途径有关，静脉注射剂量大于皮下注射； 皮下注射剂量比掌内和趾内皮下注射大； 不加佐剂剂量比加佐剂剂量大； 对于兔，加福氏佐剂，500ug/kg/次；不加佐剂，则加大5倍剂量,三、佐剂（adjuvant)增强可溶性抗原的免疫原性或改变免疫反应的类型，或节约抗原 1 类型 盐佐剂：如铝胶、明矾等 油佐剂：如白油、福氏佐剂 脂质体,2 福氏不
3、完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant) 羊毛脂： 1份 石蜡油： 5份 混合，高压灭菌后保存 3 福氏完全佐剂 加卡介苗：10-200mg 可100灭菌处理10分钟,4 油佐剂 10号白油（石蜡油） 100ml 硬脂酸铝 2g 司本 6ml 混合加热融化，分装。应用时按下列配方进行乳化： 油相： 3份 水相（加2%吐温80） 1份 在搅拌机内，油相先搅拌，后慢慢加入水相抗原乳化。,司本是油分散剂，吐温是水分散剂，硬脂酸铝是稳定剂。 乳化：将油相和水相混合的过程称为乳化 少量用注射器来回抽吸；中等量可用组织捣碎机；大量可用均质仪或胶体磨。,乳化检验： 取一滴乳化剂滴入
4、水中，如果呈球型不分散，则成功； 如果出现平展扩散，则不成功； 在保存期内如果分层，也是未乳化好,四、 免疫程序 免疫途径：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射等。抗原充足，则肌肉、皮下或腹腔等途径免疫。抗原量少，则皮内多点注射等。 间隔时间：混入佐剂皮内或皮下注射时，2-4周免疫一次；不加佐剂，则间隔1-2周；肌肉或静脉注射，间隔1周即可进行下一次免疫。 间隔时间应长短适宜，太短则起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的作用。,五、 抗体的鉴定 1 效价鉴定 即抗体的滴度，鉴定方法有：试管凝集实验、琼脂扩散实验、ELISA等。 2 特异性鉴定 通常以交叉反应率来表示。交叉反
5、应率可用竞争抑制实验来测定。,3 抗体亲和力指抗体与抗原结合的牢固程度。与分子间的作用力有关，以亲和常数K表示，通常范围在108-1010/mol 抗体亲和力的测定对抗体的筛选、确定抗体的用途、验证抗体的均一性有重要意义。 抗体冻存：加1/10000硫柳汞等防腐，小量分装，-20保存，亦可冻干保存。,六、IBDV高免卵黄抗体的制备 1 材料 IBDV弱毒苗、IBDV组织苗、IBDV琼扩抗原 2 选健康鸡群（无鸡白痢等）若干只，分别在14、28日龄免疫IBDV弱毒疫苗 90天后以IBDV组织苗加强免疫，14天后采血，进行琼扩实验，1：16为合格。不合格，重复（3） 效价合格，收获鸡蛋，4-8保存
6、备用,5 检验 物理性状：呈均一的橙黄色带胶体的液体，放置一定时间后，下沉多量的黄白色絮状沉淀 效价：大于1：8 安全检查：取3ml卵黄液皮下注射雏鸡，无任何影响 效力检验：对IBD患鸡，肌肉或皮下注射1ml，2天后80%以上好转或痊愈,七、SFV抗体制备 1 材料 SFV弱毒疫苗 2 操作方法 （1）基础免疫 选健康育肥猪若干，以SFV疫苗肌肉注射免疫，做为基础免疫 （2）加强免疫 基础免疫10天后，进行加强免疫，肌肉注射20头份 （3）7天后进行第二次强化免疫,（4） 10-14天后，收集血液，让血液自然凝固，分离血清。按0.3% 加石炭酸，无菌分装，冰箱内保存 检验 （1）物理性状 血清清亮、透明，呈草黄色或金黄色 （2）无菌检查 取血清样进行肉汤、琼脂斜面检查，观察1-3天，应无菌生长,（3）安全检查 取血样0.5ml，皮下注射小白鼠，注射3-5只，观察7天，小白鼠应健康存活 （4）效力检查SFV临床病例，血清治疗3天后，50%以上应好转或痊愈,
