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1、微观技术,马玉堃 生命科学学院 2007年3月,2 目镜 目镜的组成 目镜通常由2个透镜组成。上面一个与眼睛接触的叫接目透镜，下面一个靠近视野的叫会聚透镜或视野透镜。在上下透镜中间，或在视野透镜的下面装一个用金属制的光阑，物镜或视野透镜就在这个光阑面成像。在此可以安装目镜测微计或用眼睫毛粘贴在光阑上制成指针目镜。 目镜的效用 1）使由物镜映来的倒像，反映在目镜的光阑上，并使它再扩大成为直立的虚像。 2）可校正物镜所余下来的色差及球面差，以及补正映像的歪曲。 3）使映像投射到一定的位置上，便于做显微镜照相。,目镜的放大 目镜的放大倍数计算：目镜的放大倍数=250mm（明示距离）/fmm（目镜焦距
2、）目镜的焦距一般在出品目录上都已注明，若焦距为36毫米，则目镜放大倍数为7，这个数字在镜头上注明。在实验室常用的目镜倍数为10。若与40的物镜配合使用，则此显微镜的放大倍数为1040=400。,目镜的类型 负目镜 结构如图1-7A，最常见的一种。它是由2个平凹透镜组成。在2个透镜之间，有一个圆形的光阑。在下面的一个视野透镜，其凸面向下，作用是聚会来自物镜的光线，使之聚焦成像在光阑附近。上面透镜也是凸面向下，作用是放大映象为眼睛接受。 正目镜 这种目镜也是由2个平凸面透镜组成，如图1-7B。其凸面相对，光阑也移动到视野透镜的下面。 补偿目镜 结构比较复杂，它在焦点平面上端插入了一组消色透镜，如图
3、1-7C。这是专门为复消色差物镜设计的。因为在视野周围仍然出现色差，如果单独使用复消色差物镜，仍不能全部消除，所以就与补偿目镜配合使用以达到消除残留色差的目的。,3 集光器 集光器的效用 集光器是显微镜光学系统中的重要组成部件。其功能是收集从光源来的光线并集合成光束，以增强照度，然后经过标本再射到物镜中去。所以一般放大倍数较高的显微镜，在载物台下面均有集光器。 集光器的组成 集光器一般由2个或3个凸透镜组成，上面的透镜是平面的，如图1-8。一般显微镜都装备有阿贝氏照明装置，它是由集光器、彩虹光圈和反射镜三者联合而成，装在镜台之下的支架上，利用齿轮和齿条升降，可调节光的强弱。在更高级的研究显微镜
4、中，另外装有三个以上透镜组成的消错性集光器。能消除球面色差和色象差。图1-9。,集光器的用法 欲使显微镜发挥它的能力，除了有高级物镜外，还必须有优良的集光器配合使用，因为物镜的分辨力受集光器镜口率的影响。 物镜的有效镜口率等于镜口率加集光器镜口率再除以2。 例如：镜口率为1.2，如与镜口率为0.5的集光器配合使用，则物镜的有效镜口率为0.85，即，物镜的有效镜口率=1/2（物镜的镜口率+集光器镜口率）=1/2（1.2+0.5）=0.85。,因此，在使用集光器时应该注意以下几点： 原则上，集光器的镜口率应该与物镜的镜口率一致。通常集光器上刻有最大镜口率的数值，如N.A.1.0，1.2，1.4等。
5、应该根据情况来调整。 集光器镜口率在1.0以上时，要用香柏油浸没在集光器上面的透镜与载玻片之间，以便使高倍物镜发挥作用。 若照明光线过强时，可以降低集光器或缩小光圈，但都会减低显微镜的分辩力。所以最好是改变电灯的亮度，或利用深色滤光片或增加滤光片数量。 若检查的标本是活体或没有染色，则需要缩小集光器下的光圈。因为照明的光束越小，明暗对比越明显。,显微镜的放大率：也称放大倍数。显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜的放大倍数的乘积。公式为：,M为总放大倍数， K1为物镜放大倍数， K2为目镜放大倍数， 为光学镜筒长(单位：mm)，f1为物镜焦距(单位：mm)，f2为目镜焦距(单位：mm)， 250为明
6、视距离(单位：mm)。 由公式可知，物镜的放大率是对一定镜筒长度而定的，镜筒长度的变化，不仅放大率随之变化，而且成像也受到影响。因此使用显微镜时，不能任意改变镜筒的长度。所谓标准光学镜筒长是指物镜的后焦点与目镜的前焦点之间的距离。国际上将显微镜的标准镜筒长定为160mm，此数字标刻在物镜的外壳上。,第三节 显微镜的照明原理以投射光为照明光,显微镜有2种照明方式： 一种为临界照明,光源经扣光镜后会聚在被检物体上,光束窄而强,这是它的优点.但是光源的灯丝像与被检物体的平面重合,这样就造成被检物体的照明呈现不均匀性,在有灯丝的地方明亮,无灯丝的地方暗淡,不仅影响质量,也影响照相.,另一种为柯拉照明,
7、照明光路有许多组件,包括光源、集光器、视场光栏、孔径光栏、集光器和物台等。在此照明中, 集光器透镜的2侧,灯丝和孔径光栏为一共轭面. 灯丝的成像在孔径光栏平面上. 集光器透镜的2侧视场光栏和物台为一共轭面,视场光栏的像呈现在物台上.因此,比临界照明优越.一是照明均匀,二是通过调整视场光栏大小和位置可以控制标本平面上照明区的大小和位置。当只需要观察或测量标本的一部分时，可以关小视场光栏，减小照明区域，使标本的其他部分不受热，并且减少了杂散光的干扰。,第四节 显微镜的使用 1观察前的准备工作(1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。(2)观察时所用的
8、材料、药品和各种器具要预先准备好。(3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节，其操作步骤如下：,可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整；如果可变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它的中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。 载物台上放置观察标本，把聚光器上升到它上端透镜平面稍低于载物台平面的高度，并将它的可变光栏开到最大，用低倍物镜，进行调焦到能看见标本，可调反射镜使视野得到最亮和最均匀的照明，或把光栏关小，最亮的照明区正处在视野的中
9、央。转到高倍镜，并调焦到看清标本，然后去掉标本，拔出目镜，眼睛直接向镜筒观察，并把可变光栏关小，看其亮点是否在视野中心，如果不是，就要转动聚光器的调节螺旋，把亮点调到视野中央，再慢慢开启可变光栏，使视野看到光栏边缘和聚光镜的边缘相接为止。,2显微镜的照明操作 (1)当用天然光、日光灯及其他各种没有聚会透镜及光栏的显微镜灯或普通台灯照明时，因射来的光束宽，也比较均匀，操作比较简单，其步骤是： 先使显微镜正对光源，让反射镜镜面充分接受射来的光，把聚光器上升到它上端透镜平面痢稍低于载物台平面的高度。 将低倍物镜转到工作位置上，在载物台上放一标本片，把聚光器下的可变光栏开到最大，调节反射镜，使光线透过
10、标本进人物镜。调焦到能看清标本，去掉标本后，再仔细调节反射镜，使视野得到最亮和均匀的照明，或照明最亮的区域正处在视野中央，然后进行其他操作步骤。,(2)当使用带有会聚透镜和可变光栏的显微镜灯时，虽然也可以照上述方法取得一般照明的效果，但要得到均匀而较强的照明，则应采用柯拉照明法。一般显微镜的光源装置在镜座中，开启光源开关，把灯光亮度调到34档(或3V)即可。3聚光器和物镜配合的操作及滤光片的选择 (1)聚光器与物镜不但其性能要相匹配，而且两者的数值孔径要相一致。在完成上述照明操作之后，对无标明数值孔径的聚光器，先取下目镜，直接向镜筒中看，把聚光器下的可变光栏关到最小，然后才慢慢开大，让它的口径
11、与视场的直径恰好一样大。最后安上目镜选用适当的滤光片，即可进行观察。,(2)滤光片的选用：根据观察的目的要求，采用合适的滤光片，有如下选择： 防止耀眼和减轻眼睛疲劳。当光线太强耀眼难受时，单为了削减入射光，可采用乳白玻璃或白色毛玻璃滤光片。最好根据标本染色的情况，选用一个绿色，黄绿色或蓝绿色的滤光片，把能刺激眼睛的红光吸收掉，以减轻眼睛的疲劳。增进分辨率。根据显微镜分辨率的原理可将白光中波长较长的光波吸收掉，而利用所通过的较短波长来照明，可以达到增进分辨率的目的。例如用一个绿色或蓝色的滤光片就可以达到目的。增大明暗反差。当需要利用标本的反差来识别其结构时，就要通过合适的照明来加强反差，其方法是
12、选用一个颜色与标本颜色互补的滤光片。各种颜色互补色可见表11。,4观察操作 在完成上述各步的操作之后，便可在载物台上放上待检的标本片，进行调焦和观察。 (1)低倍、高倍镜的使用：先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片0.5 cm处，然后一边观察视野一边上升物镜，直至看到图像，再将标本移到视野中心，用细调焦螺旋把物镜调至最清晰处，若要用高倍镜观察时，把所要进一步放大观察的部位移至视野中央，直接顺时针转换成高倍物镜，然后用细调焦螺旋凋焦，至看清物像。,(2)油镜的使用：先用低倍物镜观察标本的概况，然后更换高倍镜，并把需要用油镜观察的部位移到视野的正中央，再进行油镜观察操作： 把镜筒向上提升约1.
13、5cm(有的是载物台向下降1.5cm)，再把油镜转到工作位置。 在聚光器和盖玻片上所要观察的位置各滴一小滴香柏油或石蜡油，一边从侧面观察油镜头，一边细心拧动粗调焦螺旋，使油镜头的前端与油滴接触，再慢慢下降油镜，使其前端接近而没有碰到盖玻片为止，最后，一边观察视野中的图像，一边拧动细调焦螺旋，使镜筒稍为上下升降看清标本。,观察完毕后，提升物镜约1cm，把油镜转离光轴，及时做清洁工作。油镜先用干的擦镜纸擦12次，把部分油去掉，再用清洁剂(70乙醚+30无水乙醇)或二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，最后用干擦镜纸擦1次。擦拭要小心，动作要轻，聚光器上的油滴也用同样方法处理。擦拭时，要顺镜头的直径方向，而不要
14、沿镜头的圆周擦，载玻片上的油可用“拉纸法”擦净，即把一小张擦镜纸盖在载玻片上，在纸上滴一些清洁剂或二甲苯，趁湿把纸往外拉，这样连续作了34次，即可干净。最后，把聚光器下降约1cm，把物镜转离光轴，使镜筒下端正处在两个物镜之间，置于阴凉处保存。,Olympus显微镜观察的顺序操作 1将电源开关置于ON的位置。 2电压调至 79 V。 3将LBD-2滤色镜放人灯室的窗口，根据亮度选用适当的ND滤色镜放人灯架一侧。 4把标本放在载物台上。 5用物镜(10x)对准焦点。 6调节双目镜筒的间距，以适合观察者眼瞳，同时调整两眼的屈光度。 7缩小视场光栏(约视场的13)。 8将聚光镜上下移动调节，对准视场光束焦点。 9用两个调整螺杆把聚光镜的中心调整到视场的中心。10把视场光栏调整到与目镜的视场外接处的附近。11使用低倍镜，转动载物台的移动标尺，找出标本的位置。12如果已找到观察位置，则更换物镜(高倍镜或油镜)，按所要求的放大倍数进行观察。,
