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1、性别鉴定与性别控制,王 锋 王子玉 南京农业大学动物科技学院 南京农业大学动物胚胎工程技术中心,一、性别控制定义 二、性别控制的意义 三、性别控制的方法 （一） 早期胚胎性别鉴定 （二） 晚期胚胎性别鉴定 （三） 精子分离方法 （四） 母畜受精环境的控制 （五） 鱼类、两栖类等低等动物的性别控制,一、性别控制定义,在正常情况下，自然界动物群体公、母性别比例基本上近于1:1，保持性别比例平衡是生物进化的结果。 性别控制(sex control，SC)指通过人为干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术。,畜牧生产中，肉、奶、蛋等重要经济性状在性别间有差异，有的是限性性状。 奶
2、 牛 蛋 鸡 长毛兔：产毛量母兔优于公兔,二、性别控制的意义,目的是在动物出生前即用人工方法控制其性别，以改变后代的自然性别比例，进而按照人们的意愿进行特定性别的畜禽生产，显著提高畜牧业经济效益。 这对高效优质的发展畜牧业具有重要意义： 可使受性别限制的生产性状（如泌乳性状）和受性别影响的生产性状（如肉用、毛用性状等）能获得更大的经济效益；,可增强良种选育中的选择强度，加快遗传改良的进度； 可以排除畜群中有害基因或不理想的基因（如避免患有伴性遗传疾病后代的出生）等。 对人类来说可以避免怀孕一个与X相关隐性疾病的婴儿。对于平衡一个家庭后代的性比例也起到积极的作用。,三、性别控制的方法,主要在两个
3、方面进行 受精前：通过体外对精子进行干预，分离X精子与Y精子，使在受精时便决定后代的性别； 受精后：通过对胚胎的性别进行鉴定从而获得所需性别的后代，又细分为早期胚胎性别鉴定和确定出生前的胎儿性别然后选择性流产两种方法。,控制受精环境 生产纯合性双倍体 孤雌生殖 显微注射已知性别精子 反复克隆已知性别的胚胎或体细胞等。,应用现代分子生物学技术对早期胚胎进行快速、准确的性别鉴定是可行的，已出生了后代。但由于早期胚胎性别鉴定需从胚胎上取下少量细胞，对胚胎有一定损害，经冷冻-解冻处理后仅有少量胚胎存活，导致胚胎移植的成功率下降，这就制约了提供预知性别家畜胚胎的商业化进程。,（一）早期胚胎性别鉴定,1、
4、细胞遗传学方法 （核型分析）,操作过程:先取少量的胚胎细胞，在含有秋水仙素的培养液中培养，使细胞的有丝分裂停留在中期； 用低渗溶液使细胞膨胀，细胞膜破裂释放染色体，然后固定，用姬姆萨染色后在显微镜下观察。由于有丝分裂被阻滞在中期，故染色体缩短，形状规则，并有特异的带型。,通过核型分析来鉴定胚胎性别，寻找不能与X性染色体配对的Y染色体。 优缺点：准确率几乎是100%,但操作过程比较繁琐。,取胚胎上部分细胞的方法,吸取卵裂球（录像）：早期胚胎的卵裂球 胚胎切割（录像）：取囊胚的滋养层细胞,2、H-Y抗原测定法,依据H-Y抗原和抗体免疫反应的原理进行性别控制的免疫学方法。 Eirhwald和Silm
5、ser(1955)以近交系C57BL/6(B6)小鼠为材料，进行了相同和不同性别间皮肤移植实验，发现将雄性皮植片移植给雄性、雌性皮植片移植给雌性，以及将雌性皮植片移植给雄性，均不发生排斥反应。惟独将雄性皮植片移植给雌性时出现了排斥反应。,由于B6小鼠是高度近交的纯合小鼠，每一个体的遗传基础完全相同，按说不应发生排斥反应，因而认为这种雌性对雄性的排斥反应是由于雄鼠皮植片具有一种雄性特有的细胞表面成分所致。,这说明一定是由于雄性细胞有特殊要求，雌性不能提供或由于雄性动物细胞表面有一种特殊成分，对雌鼠来说是一种外来之物。 即存在一种雄性特异移植抗原，这种成分被称为雄性特异性次要组织相容性Y抗原 (m
6、ale specific minor histicmpattbility-Y antigen),简称H-Y抗原。,在哺乳动物，已发现小鼠、大鼠、兔、牛、绵羊精子上H-Y抗原的表达。 此外，在小鼠、大鼠、兔、猪、绵羊、山羊和马的早期胚胎上亦发现H-Y抗原的存在，并以此进行了植前胚的性别鉴定。,通过测定胚胎上H-Y抗原的存在与否就能对胚胎的性别做出鉴定。 胚胎的细胞毒性分析 胚胎H-Y抗原的间接免疫荧光分析法 囊胚形成抑制法。,1.胚胎细胞毒性分析 在补体存在的情况下，H-Y抗体与雄性胚胎结合，并使其中的卵裂球发生溶解，使卵裂球呈献不规则的形状。 2.间接免疫荧光分析法 染色后显荧光者为H-Y+胚
7、胎。,3.囊胚形成抑制法 利用H-Y抗体与桑椹胚共孵育，抑制雄性胚胎的囊胚腔的形成。,3、SRY基因探针法,20世纪90年代初英国学者发现存在于Y染色体短臂上决定雄性的SRY基因。 荧光原位杂交技术(FISH)根据SRY基因序列合成特异性的探针，用荧光标记，与制备的早期胚胎细胞杂交，如果具有SRY序列则可以检测到荧光，判断为雄性，反之为雌性。,荧光原位杂交（FISH）：,应用荧光素标记的DNA探针与标本进行原位杂交后，使杂交区域发出荧光。 优点：快速、安全 灵敏度高 特异性强。 图示为18三体综合征患者的FISH检测,4、PCR法性别鉴定,用聚合酶链反应(PCR)扩增SRY基因，阳性胚胎为雄性
8、，阴性胚胎是雌性，准确率可达100%。 这种方法往往是与胚胎分割等技术结合起来，先将胚胎分割，一小半用于PCR鉴定，另一大半用于鉴定后的移植。 胚胎切割与性别鉴定（录像）,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段。用两段寡核苷酸作为反应的引物，由DNA聚合酶催化一系列合成反应。一般，两段引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增区段的两侧。 每一个温度循环周期均是由高温变性、低温退火及适温延伸等三个步骤组成。,我国研究者已成功地用PCR技术直接扩增牛、绵羊等多种动物
9、胚胎的SRY特异DNA序列，能够准确地鉴定牛胚胎的性别。 这种方法准确简单，便于广泛应用。,SRY-PCR步骤：,1.体细胞和胚胎基因组DNA的提取 2.引物的合成 3.PCR扩增体细胞DNA 4.扩增DNA的检测 5.性别鉴定分析 6.胚胎DNA扩增和分析,性别鉴定的关键问题,试剂费仪器设备费人工费,鉴定是需要使用电泳仪,性别鉴定花费时间,活体切片技术基因检测,（40 分钟）,結果,活体切片 胚胎分割,采胚,受胎,产仔,PCR法 对目标基因 进行扩增,电泳鉴定结果,（3 小时 半天）,LAMP法 对目标基因 进行扩增,选择需要的“性别” 移植受精卵,Loopamp牛胚胎性别鉴定试药包 Loo
10、pamp 终点浊度仪,牛胚胎的LAMP性别鉴定,LAMP法与PCR法的比较,简便,缩短时间,总成本低廉,缩短扩增时间已经受到局限 需要电泳进行鉴定 专利费占成本的很大比率 仪器设备费昂贵,PCR法,放入所需的试剂后，只需在等温环境下保温，短时间就能鉴定结果。不需要电泳，总成本低廉。,LAMP法,简便快速精确廉价,需求,解决,提供现成试剂的意义,Loopamp牛胎胚性别鉴定试药包,看浑浊度判定扩增与否，鉴别牛胎性别。 采用引物和通用引物，最大限度排除鉴定出错的可能性。 采用浑浊度专用仪器鉴定（判定、）,与原来的方法比较 特点：简便，快速！,牛胚胎性别鉴定试剂盒的组成,1, DNA提取液（EX)
11、1.5mlX1tube 2,反应液（dNTPs，缓冲液，雄性特异引物） （RMI) 0.25ml2tubes 3,反应液 dNTPs，缓冲液，雌雄性共通引物）（RMII) 0.25ml2tubes 4, 链置换型DNA合成酶（Bst DNA polymerase） 60ul1tube 5, 对照阳性DNA （Cont.DNA） 0.1ml1tube 6, 反应用试管（单独包装） 8管12连,LAMP法配套器材器具,，胚胎切割用显微镜及显微操作仪,2, 洁净工作台罩,3, 多用途微量离心机,4, LAMP反应及浊度鉴定仪,LAMP牛胚胎性别鉴定试剂盒,Loopamp终点浊度仪 仅用一台仪器就能做
12、到扩增检出鉴定,Loopamp 牛胎胚性别鉴定试剂盒,约40分钟,不需要繁琐的电泳来进行检测和鉴定,试管移动到反应检测部,开始检测,鉴定扩增的结果,Loopamp 终点浊度仪（LA-100）,LAMP法的简便性,反 应 区,鉴定简便,总 结,性别鉴定能在40分钟内完成（快速）。 采用了雄特异引物和雌雄共通引物（避免了误判的发生）。 遗传因子的扩增及鉴定都在同一试管内进行（操作简便、避免了污染物进入）。 遗传因子的扩增可直接由混浊度判定（无需进行电泳测试） 试验用试剂及仪器成本低。 鉴定准确性：100！,（二）晚期胚胎性别鉴定,在着床后某个阶段检测胎儿的性别 B型超声波检测：有无阴囊（录像） 羊
13、水穿刺术,精子分离技术比胚胎鉴定效率更高。 它可在受精之前就控制其性别，避免了胚胎的浪费，有利于节省受体数目，降低成本。 分离X、Y精子并用于人工授精或显微受精是控制家畜性别最简单、可行的方法。,（三）精子分离方法,哺乳动物精子可分为两类，一类携带X染色体 (X精子)，一类携带Y染色体 (Y精子)。 这两类精子在比重、体积、表面电荷、表面抗原等方面略有差异。根据这些差异，设计了诸如沉降法、离心法、过滤法、电泳法、H-Y抗原法等分离方法试图将这两类精子分开，达到控制后代性别比例的目的。,其中流式细胞仪分离法具有准确率高（85%95%），可靠性强，易于重复，较为省时等优点，是最有发展潜力和应用价值
14、的精子分离方法。 牛：500-800元头份。是普通精液的20倍。,1、流式细胞仪法分离精子,流式细胞术（flow cytometry，FCM）是近年迅速发展起来的细胞或细胞颗粒定量分析和进行细胞分类研究的新技术， 流式细胞仪（flow cytometer）又称荧光激活细胞分类器（FACS）是流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术综合性的高科技产品。,主要组件：液流系统、激光器、荧光检测器、散射光检测器、偏转板、细胞收集器以及电子控制系统和计算机系统。 这种分类技术可以测定细胞的大小、数量和类型，并可依赖荧光染色测定DNA含量和蛋白质水平，同时根据其差异进行分离。,1.1原理与方法,流
15、式细胞仪精子分离法是根据X、Y两类精子在DNA含量上的差异来分离精子。通常，X精子的染色体比Y精子的大且DNA含量较高。（人：差异为2.8，家畜：差异3.04.2） 操作方法是将精液用活体荧光染料Hoechst33342孵育染色。然后在精子逐个通过细胞分类器的微柱时，用一束激光激发荧光染料，使通过微柱的精子发光。,X精子发光量略高于Y精子。这种发光量的微小差别由光学检测器记录并把信号送给计算机。精液通过激光束后，便被分成微滴。 计算机把信息反馈到产生微滴的部位，使每个微滴带电：X精子带正电，Y精子带负电。当带电精子进入偏转电场后，两类精子便分别向不同的方向移动，进入不同的容器。 分离后的部分精
16、子未受损伤，可用于受精。,1.2 存在问题,相对于人工授精的输精量（一千万个精子）而言，它的分离速度太慢，每小时只能分离35万个精子（2001年数据）。 同时，这种方法的技术成本也太高（30万美元）。,该法所获得的首例成活后代是经子宫内手术授精出生的兔子。 英国剑桥动物生物有限公司最早于1993年开展用分离精子进行牛IVF研究并获得成功。 分离精子在人临床上和畜牧业上的应用。,精子受精力比正常精子低，解冻后的活力和顶体完整率低等。分离过程不会影响受精，但可能会影响早期胚胎和胎儿的发育 。 造成这些问题的原因是多方面的，如荧光染色、稀释、冷冻、分离前后的保存、分离过程中紫外线的照射及机械损伤等，都可能会对精子产生不利影响。现已证实，分离过程会损伤精子细胞膜，从而使活力、存储能力和受精能力下降。,
