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1、配位化学在细胞凋亡中的应用,报告人：张煜导师：唐瑜教授,配位化学在细胞凋亡中的应用,一、细胞凋亡的简介,二、文献,三、设计思路,四、总结,配位化学在细胞凋亡中的应用,一、细胞凋亡的简介,1972年Kerr根据细胞发生与坏死不同的死亡现象，提出了细胞凋亡的概念，称为Apoptosis，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。而细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）最初是1956年发育生物学中提出的概念，是个功能性概念，强调的是其分子生物学和生理功能，一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的、并受到严格程序控制的正常组成部分。在现在
2、的研究中把二者作为一个意思解释。随着分子生物学检测技术的飞速发展，近二三十年来，细胞凋亡的研究取得了重大的突破，越来越受到医学界和生物学界的普遍关注。尽管人们尚未完全掌控细胞凋亡，但是目前人们对细胞凋亡机制和凋亡异常导致的疾病有了比较全面的认识，并且根据细胞凋亡的不同特征，形成了不同的凋亡检测方法。这些都为人们更加深入地研究细胞凋亡奠定了坚实的基础，也为对疾病的新认识打下了分子生物学基础。而且也为解决恶性肿瘤的医学难题指明了新的方向。,凋亡细胞的特征,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years
3、experience,细胞凋亡过程可分为三个不太明显的阶段：感应阶段、效应阶段和分解阶段。感应阶段通过死亡诱导信号刺激凋亡前信号大量转变。这种死亡诱导信号包括氧化还原种类、神经酰胺信号、Ca2+的超活化途径和Bcl家族蛋白如Bax和Bad。在第二阶段，即效应阶段，在关键调节器线粒体的作用下，细胞开始死亡。最后的分解阶段包含了细胞质和核质两个部分。在细胞质中一种叫caspases的复合级联蛋白被激活；在细胞核中，染色质浓缩，核膜破裂DNA被分解成若干小片段。最后细胞被分解成若干凋亡小体，在表面的磷脂酰丝氨酸被识别后被邻近的细胞或者吞噬细胞所吞噬。从细胞发生凋亡开始，到出现凋亡小体仅需数分钟，而被
4、吞噬消化整个过程可持续49 h。,凋亡细胞的特征,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience,早期凋亡细胞及活细胞的胞膜正常，对DNA染料碘化丙锭（PI）拒染，但可被另外一种DNA染料Hoechst 33342（Ho33342）染色；而坏死细胞的胞膜完整性受到破坏，细胞不需固定即可被PI染色。凋亡细胞在凋亡早期原来位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）翻转至磷脂双分子层外侧。凋亡发生时线粒体呼吸链受损，使细胞生成ATP的量减少；跨膜电位降低，细胞色素c从线粒体内漏到胞质中；线
5、粒体膜的通透性升高。胞浆中Ca2+和Mg2+浓度升高，可以激活核酸内切酶和蛋白酶激活的核酸内切酶可以将DNA切成50300 bp大小的DNA，然后进一步将染色质裂解成单个核小体和寡聚核小体，形成180200 bp的DNA片断。,配位化学在细胞凋亡中的应用,二、文献报道,Conjugates of ferrocene with biological compounds. Coordination to gold complexes and antitumoral propertiesJournal of Inorganic Biochemistry 105 (2011) 13731382,在这篇
6、文献中，他们合成了一系列带有生物配体的二茂铁配合物。并且将这些配合物和Au(I)和Au(III)结合。他们检测了这两个基团的结合位点。而且这两个基团结合表现出很好的抗癌活性。他们将金的配合物运用到三种癌细胞中：MCF-7（人类的乳腺癌细胞）、HeLa（人类的宫颈癌细胞）和NIE-115（来源于老鼠的交感神经囊肿神经元细胞）。检测这些配合物对癌细胞的作用。,Scheme 1. i) L-histidine methyl ester, ii) histamine, iii) L-tryptophan methyl ester, iv) L-methionine methyl ester, v) L
7、-lysine ethyl ester , vi) L-prolinamide.,第一步、合成所需的配合物,Scheme 2. i) Au(acac)(PR3), ii) Au(acac)(PR3), iii) Au(OTf)(PR3), iv) Au(C6F5)3(OEt2).,第二步、基于MTT比色法检测IC50值的实验,Cells were exposed to each compound for a total of 48 h. Using the colorimetric mitochondrial function-based MTT viability assay, the IC
8、50 values (final concentration0.5% DMSO) were calculated from dose-response curves obtained by nonlinear regression analysis. IC50 values are concentrations of drug required to inhibit tumor cell proliferation by 50%, compared to the control viability.As demonstrated by the IC50 for 48 h values list
9、ed in Table 4, the tested ferrocene bioconjugates do not show significant antiproliferative activity but the gold complexes appeared to be quite effective as cytotoxic agents against in vitro growth of various cancer cell lines.,MTT比色法原理,MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氧酶使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶
10、甲瓒，并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒。用酶联免疫检测仪在440nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。MTT结晶形成量与细胞数成正比。,IC50值的简介,IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应，抗原抗体反应等。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低，当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。,IC50 (48 h) of complexes aga
11、inst HeLa, MCF-7, and N1E-115 cells.,Fig. 3. Variation of cell survival with the incubation time (complex 10).,第三步、流式细胞记数法,Flow cytometry studies using double staining with Hoechst 33342 and propidium iodide showed also a significative percentage of apoptotic cells after incubation of MCF-7 cells wi
12、th increasing concentrations of compound 10 (10 and 50 M) for 3 and 24 h (Fig. 4 and Table 5).The use of the molecular probe H2DCF-DA showed that incubation of MCF-7 cells with compound 10 produced an increasing dose and time dependent amount of reactive oxygen species (ROS) (Fig. 5 and Table 6).,Fi
13、g. 4. FCM of light scatter of apoptotic MCF-7 cells. Cells were incubated for 3 and 24 h with complex 10 at 10 and 50 M. a) 10 M for 3 h; b) 10 M for 24 h; c) 50 M for 3 h and d) 50 M for 24 h.,Table 5 Percentage of apoptotic, dead and live cells after incubation with complex 10.,Fig. 5. FCM of ROS
14、production using H2DCF-DA (2,7-dichlorodihydroflurescein diacetate).a) Control (non-treated cells); b) Positive control (cells incubated with500MH2O2.Cells incubated with complex 10 for 3 and 6 h at 10 and 50 M. c) 10 M for 3 h; d) 10 M for 6 h; e) 50 M for 3 h and f) 50 M for 6 h.,Table 6 Productio
15、n of reactive oxygen species (ROS) by MCF-7 cells incubated with complex 10.,三、设计思路,1、合成一种新的配体，它可以和金配位,2、设计一条多肽链作为caspase-3酶作用底物,3、这条肽链经酶作用后可以和金配合物作用,Content,2,3,1,这条肽链经caspase-3酶作用后得到的短肽链不仅含有两个巯基，还有两个氨基，易于和金纳米颗粒结合。,合成的这种配体带有颜色基团，当和金配位后颜色消失。,当肽链把金从配体中竞争下来后，配体就会显色，从而达到检测caspase-3酶活性的目的，从而达到检测细胞凋亡的目的。,四、小结,对于科研工作，它包含有以下4个步骤：,1、查找文献,2、设计自己的实验思路,3、设计实验步骤，运用实验来证明自己的想法,4、从实验结果来验证自己的想法是否正确,Thank you!,
