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1、第八章 食品中致病菌和病毒,8.1 肠杆菌科,肠杆菌科是存在于人和动物肠道或自然界中的一群生物学性状很相似的革兰氏阴性短小杆菌。无芽孢，多数有周身鞭毛，能运动。 在普通培养基上能生长。 培养温度为35C。 需氧或兼性厌氧。 能还原硝酸盐为亚硝酸盐，氧化酶试验阴性，触酶试验阳性。,8.1.1大肠杆菌,大肠杆菌E. coli是肠道正常菌群。一般情况下，多不致病，是人和动物肠道中的常居菌。 在一定条件下，可引起肠道道外感染。 致病性大肠杆菌：肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli); 肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E. coli); 肠侵袭性大肠杆菌（
2、Enteroinvasive E. coli); 肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E. coli)。 引起腹泻、出血性肠炎。,肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli，ETEC) 引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重霍乱样症状。腹泻常为自限性，一般23d即愈。 鉴定ETEC主要测定大肠杆菌肠毒素，血清型有一定的参考意义。,肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E. coli，EPEC)是婴儿腹泻的主要病原菌，具有高度传染性，严重者可致死，成人少见。EPEC产生VT毒素。 VT毒素具有神经毒素、细胞毒素和肠毒素性。 鉴定EP
3、EC根据临床表现和血清型。,肠致病性大肠杆菌,肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E. coli，EIEC) EIEC的多数菌株无动力，生化反应和抗原结构均类似痢疾杆菌。EIEC可引起豚鼠角结合膜炎，临床上可借此协助鉴定EIEC。,肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E. coli，EHEC)可引起散发性或爆发性出血性结肠炎。主要菌型是O157：H7，还可有O26、O111、O103、O145等。 1996年O157：H7在日本引起万人的食物中毒，此外，美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、英国等国家和地区相继报道了EHEC O157：H7的散发性感染和爆发流行。 我国于
4、1999年在苏、皖、鲁、豫发生爆发流行。,肠出血性大肠杆菌,肠出血性大肠杆菌O157: H7的检验方法： 1、培养基制备 改良EC新生霉素增菌肉汤 （mEC）： EC肉汤灭菌后添加20mg/mL过滤除菌的新生霉素，使终浓度为20g/mL。改良山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）：山梨醇麦康凯琼脂加入过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液，使终浓度2.5mg/L，头孢克污，使终浓度为0.05mg/L。 MUG-LST肉汤：LST肉汤中添加4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使终浓度为0.1g/L。 2、增菌培养 称取25克样品放入225mL mEC中，均质。于411培养18-24小时。,3、分离 将m
5、EC肉汤培养物10倍递增稀释。从10-4，10-5，10-6稀释度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于361培养1824小时。 可疑 EHEC O157:H7菌落扁平，透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色中心，直径约2mm。 4、鉴定 挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接种MUG-LST，于361培养1824小时，出现产气，且无荧光者，分离到普通营养琼脂。 对纯菌落用EHEC O157:H7标准血清或胶乳凝集试剂作凝集试验，必要时进行生化试验。 在检测过程中，也可以在选择性增菌后，取出5mL增菌液，经100水浴15分钟灭活后，供自动酶联荧光免疫测试（VIDAS），迅速获得初步结果，阳性反应者
6、需作进一步证实。,EHEC O157:H7检验程序图解 检样25g mEC225mL 酶联荧光免疫测试VIDAS快速筛选 411，18-24h 10-4，10-5，10-6稀释度涂布TC-SMAC 361，18-24h 挑取5-10个可疑菌落接种MUG-LST 361，18-24h MUG阴性培养物转种普通营养琼脂 生化反应鉴定 血清凝集鉴定或胶乳凝集试验,生化试验： 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。 1 色氨酸肉汤：在361培养242h后,加Kovacs氏试剂0.20.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。 2 MR-VP培养基：在361培养482h。以无菌操作移取培养物1 mL
7、至13mm100mm试管中,加5-萘酚乙醇溶液0.6mL,40氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。 将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。 3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于361培养96h记录有无生长。 4 LST肉汤：于361培养482h,观察试管中是否产气。 5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。,靛基质（Indole）试验： 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯
8、醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于361C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂23滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。,甲基红（Methyl Red）试验 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。 V-P试验 某些细菌在葡萄糖蛋白胨
9、水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。 大肠杆菌：MR + /VP -,枸椽酸盐试验： 某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。,用上述方法在样品中分离获得的纯菌落，经抗E.coli O157:H7标准血清或EHEC O157:H7胶乳凝集测试为阳性者，报告检出肠出血性大肠杆菌O157:H7。 如需要进一步检测Vero毒素基因的存在，可通过接种Vero细胞或Hela细胞，观察细胞病
10、变进行判定，或可使用基因探针检测和聚合酶链反应（PCR）检测法。,大肠杆菌的检测,（1）常规检测方法国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。361培养482h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，361培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管361培养242h，观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。,原国家商检局制订的行业标准
11、，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法： 推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。361培养482h，观察是否产气。 证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，361培养482h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。,(2) PCR方法,大肠杆菌是食品和水源污染粪便的指示菌。 Gene-TARK研制出用浸染棒检测大肠杆菌中16SrRNA的探针，样品需前增菌处理，以异硫氰荧光素（FITC）标记探针，再用辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体检测杂交复合物。
12、 Hsu等报导此方法特异性（除相近的志贺氏菌外）达100，假阳性率达1.2。,8.1.2 沙门氏菌属（Salmonella),沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各国各类细菌性的食物中毒中，沙门氏菌常居前列。因此，沙门氏菌的检测是各国检验机构对多种进出口食品的必检项目之一。 沙门氏菌属是肠杆菌科中最复杂的菌属。它属于革兰氏阴性杆菌。可根据沙门氏菌的菌体抗原（O抗原）分群（A, B, C等），再根据其鞭毛抗原（H抗原）分血清型（1、2等）。,沙门氏菌不产生外毒素，但能产生毒力较强的内毒素。 沙门氏菌主要通过食物、饮水经口感染。可存在多种食物中，包括生肉、禽、蛋、奶制品、虾、鱼和田鸡腿等。
13、沙门氏菌主要通过食物、饮水经口感染。根据侵入机体沙门氏菌菌种的不同，在临床上引起四种不同的疾病。,（1）伤寒、副伤寒由沙门氏属中的伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。 （2）食物中毒沙门氏菌属引起的食物中毒，主要以肠炎杆菌、鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌和汤普逊杆菌等最为多见。临床症状主要是胃肠炎。病程较短，一般24d, 可完全恢复。 （3）败血症多为猪霍乱杆菌引起，甲、乙、丙型副伤寒杆菌和肠炎杆菌亦可引起败血症。 （4）慢性肠炎沙门氏杆菌可引起慢性、持久性肠炎。,从食品中分离沙门氏菌样品制备,由于食品种类繁多，且每类中包括许多品种。因其加工方式不同，导致性状各异。故在进行微生物学检
14、验时，应按不同的形状、加工方式及检验目的合理进行检样处理。 检样处理 冷冻的检样 在检样前最好不要解冻，将沙门氏菌的损伤降低到最低限度。 粉状样品 应将225ml增菌液分数次加入，并用灭菌玻棒搅拌成均匀悬液。 带壳蛋类 在流水下用刷子刷洗蛋类，并沥干。将蛋类在含0.1十二烷基磺酸钠的200mg/kg Cl-溶液中浸泡30min后方可破壳取蛋。,检测方法,从食品中分离和鉴定沙门氏菌，当前通常采用的方法共分5个步骤： 前增菌：食品样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。 选择性增菌：此培养基允许沙门氏菌持续增菌，同时阻止大多数其他细菌的增殖。 选择性平板分
15、离：采用固体选择培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。 生物化学筛选：排除大多数非沙门氏菌，也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。 血清学技术鉴定培养物菌种。,（1）沙门氏菌的增菌和分离 预增菌 将制备好的预增菌试液于35培养24h后，轻轻振摇培养液。 选择性增菌 选择性平板分离 混匀培养物，用直径3mm的接种环，1满环（10ul）分别划线接种于亚硫酸铋（BS）琼脂、木糖赖氨酸去氧胆酸盐（XLD）琼脂和HEKTONE氏肠道菌（HE）琼脂平板上，于35培养24h后，根据沙门氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征挑取典型或可疑菌落。,（2）沙门氏菌的筛选和生化、血清学
16、鉴定 筛选 用灭菌接种针挑取每个典型或可疑菌落的中心部位，分别接种三糖铁（TSI）、赖氨酸铁琼脂斜面，于35培养24h。在TSI琼脂中，典型的沙门氏菌培养物可使斜面呈碱色（红色），底层呈酸色（黄色），产生H2S（琼脂变为黑色）或不产生H2S。 生化学、血清学鉴定 混杂培养物 对呈混杂的TSI琼脂培养物，皆应划线于MC、HE或XLD琼脂上，于35培养24h后，进行重新分离并至少挑取2个可疑菌落接种到斜面上进行鉴定。, 纯培养物 将每个可疑阳性的TSI琼脂斜面培养物，分别接种于尿素肉汤中，35培养24h，获取多量的琼脂斜面培养物接种于快速尿素肉汤中，于37水浴培养2h。弃去所有呈阳性结果的培养物，保留所有呈阴性反应的培养物作进一步鉴定。 血清学多价鞭毛（H）试验 血清学多价菌体（O）试验 菌体（O）群试验 鞭毛（H）试验阴性培养物的诱导 （3）结果判定,
