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1、口蹄疫病毒,Lecture 18,口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要感染偶蹄兽，除猪、牛、羊等主要家畜外，也感染30多种野生反刍动物。,FMDV是第一个被鉴定出的动物病毒，早在1898年Loeffler和Frosch发表了FMD研究委员会报告一文，首次证实该病是一种比细菌小的可滤过性的传染因子引起。,口蹄疫病毒过滤性病毒中的小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，是最小的动物病毒 。 口蹄疫一般可分7个血清型：、Asia1和南非STA1、STA2、STA3。每一型之中又分出很多种，毒力不同，各型抗原性不
2、同，互相之间不能互相免疫。,FMDV Genetics,Seven serotypes or genetic groups O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3, Asia1 South America- O, A, C Europe- O, A, C Africa- O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 Asia- O, A, C, Asia1,FMDV Genetics,Virus is easily inactivated,Heat (drying- low humidity) UV light (sunlight- clear day) Disinfecta
3、nts pH 9.0,FMDV的地理分布,SAT型主要发生在非洲撒哈拉地区，O型和A型广泛分布于非洲大部分地区、南亚、远东（无A型）和南美，C型主要存在于印度次大陆，而Asia1型仅限于南亚地区。 目前，欧洲、中北美洲、希腊、澳大利亚和大洋州均属于无口蹄疫区。,拓扑型的确定,通过比较结构蛋白VP1基因序列可对FMDV进行基因分型。 O型VP1基因序列的综合分析，按照其核苷酸序列相差15的标准，将0型FMDV共分为8个拓扑型毒株。 A型、C型和Asia1型也参照O型分类的方法来分类。,O型FMDV,将O型分为8个拓扑型，分别命名为Cathay型、中东南亚型(ME-SA)、东南亚型(SEA)、欧洲
4、南美型(Euro-SA)、印度尼西亚1型(ISA-1)、印度尼西亚2型(ISA-2)、东非型(EA)、和西非型(WA)。 Sangare还将O型FMDV分为A-G七个基因型。,Asia 1 型FMDV,山东泰安、江苏无锡、新疆布克赛尔、北京延庆、河北三河，相继发生亚洲I型口蹄疫疫情。 亚洲I型口蹄疫是新传入我国的。 从抗原性角度来看，Asia1型病毒要比其它血清型变异程度小得多。仅有三个抗原亚型，所有分离株可能都属于一个拓扑型。,FMDV- Structure,病毒基因组,完整病毒含有RNA、衣壳蛋白及少量装配过程中夹带的非结构蛋白和宿主细胞肌动蛋白。 基因组为单股正链RNA , 全长约8.
5、5kb, 可直接作为信使RNA 。 FMDV 基因组RNA 由5非翻译区(Untranslatable Region, UTR )、3UTR 和一个大的开放阅读框架(ORF) 组成。,FMDV- Structure,AAAAAAAAAn,L,P1,P2,P3,5 UTR,3 UTR,VPg,VP4,VP2,VP3,VP1,2A,2B,2C,3A,3B,3C,3D,Poly C,Capsid,Non-structural proteins,IRES,WRLFMD,L：引导肽 IRES：内部核糖体进入位点 ORF长约6. 5kb, 由L(引导肽)、P1结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因以及起始
6、密码子和终止密码子组成 VPl和VP3是主要免疫性抗原 三个主要的蛋白酶: Lpro 、2A、3Cpro,Scheme of FMDV Genome,5非翻译区(5-UTR),蛋白质帽状结构：在感染细胞细胞内其基因组RNA起始于pUp结构，并共价结合一个短的病毒多肽3B蛋白。 Poly（C）区：FMDV不同分离株poly（C）区长度不相同，有人认为其长短与病毒毒力有关 内部核糖体进入位点(IRES)：存在与病毒的翻译控制有关的五个结构域，并可与瞬时蛋白及许多细胞因子发生作用。主要介导病毒RNA高效的转录活性。,L蛋白酶,Lpro宿主蛋白合成的开关Lpro可裂解 eIF4G（帽依赖性转录起始因子
7、）导致宿主帽依赖性mRNA转录关闭。 Lpro病毒毒力的重要决定因素缺少Lpro蛋白基因，病毒基本没有致细胞病变的作用，是病毒引起动物发病的一个重要因素。,结 构 蛋 白,四种结构蛋白(VPl、VP2、VP3和VP4)构成FMDV衣壳蛋白。 病毒粒子结构蛋白呈三维立体结构排列并构成口蹄疫病毒的抗原位点。 纯化的VP1或者蛋白酶水解的VP1片段可以诱导动物机体产生中和抗体，同时也能保护动物避免遭病毒的攻击感染。,VP1片断，突出在病毒粒子的表明有G-H环，此环包含有FMDV的主要抗原决定簇。 G-H环上存在着Arg-Gly-Asp(RGD)三肽的motif，是病毒粒子与细胞受体结合的关键。 研究
8、发现，FMDV VP1基因的年变异频率大约为1，这样每隔三十年将出现一个新的血清型，每十五年会出现一个拓扑型。,结 构 蛋 白,VP1 (complete),FMDV O Topotypes - 2001,非结构蛋白(Nonstructural proteins),非结构蛋白参与病毒RNA的复制、蛋白质折叠及病毒的组装，由基因组P2和P 3区所编码。 FMDV的2B和2C蛋白已经被认为与细胞致病变作用相关。 Nunez的研究表明3A对于病毒表型的改变由重要作用。 3A与病原宿主范围的选择也有关。 3C蛋白酶(3Cpro)：病毒聚合蛋白裂解的主要酶类，可以裂解宿主细胞蛋白质。,3非翻译区,Pol
9、y(A)有利于基因组负链的合成 删除3UTR的部分碱基，基因组就不能翻译出FMDV,FMDV-Immunity,Serotype specific- FMDV no cross protection Polio 3 types- good immunity Human Cold virus many serotypes (over 100)- no cross protection,FMDV-Immunity,Duration of immunity (How long an animal is protected) - immune for 1 year after natural infe
10、ction Poliovirus, mumps, measles- lifelong Human Cold virus- short duration,FMDV-Immunity,Vaccines- effectiveness varies- e.g. Egypt-short duration less than two months Cant distinguish between vaccinated animal and naturally infected animal,传 统 疫 苗,弱毒疫苗虽然有较好的免疫力，免疫持续时间长，接种量少；但存在散毒和毒力返祖现象。 灭活疫苗接种剂量较
11、大，免疫持续时间相对较短，需要低温保存，诱导的抗病毒免疫机制的广谱性有限，不能解决持续性感染的问题。,新 型 疫 苗,基因工程疫苗 合成多肽疫苗 重组活疫苗 核酸疫苗(DNA疫苗),基因工程疫苗,1981年Kleid等首次应用重组DNA技术在大肠杆菌中表达了FMDV VPI融合蛋白并制备实验疫苗，在牛和猪体内均可诱导中和抗体的产生。 Belsham等应用痘苗病毒载体同时表达了FMDV衣壳蛋白前体(P1-2A)、L蛋白和3C蛋白酶。 有实验表明：腺病毒载体共表达产生的P1-2A即使不裂解，也可诱导小鼠和猪的中和抗体及保护作用的产生，重复免疫后效果更为明显。,基因工程疫苗,Wigdorovitz等
12、用重组烟草花叶病毒(TMV)在烟草属植物中表达VPI基因，叶子抽提物注射豚鼠后其体内可产生完全病毒粒子和主要抗原区的特异性抗体。 开辟了一条利用重组植物病毒感染植物以表达FMD免疫原蛋白用于防制口蹄疫的新途径。,合成多肽疫苗,Bitlle首次根据O1型口蹄疫病毒VPI基因氨基酸序列化学合成了20个氨基酸(140-160即B细胞抗原表位)的肽段，并与载体蛋白相藕联，接种豚鼠产生中和抗体并具有保护作用。 人们又对增加200-213位(T细胞抗原表位)氨基酸组成的40个氨基酸肽进行了研究，大大提高了单段肽在豚鼠的应答水平，并证明了VPI羧基端氨基酸的类别在提高保护应答中的重要性。,Chan EW等将
13、O1K型FMDV的VP1(141-160位和200-213位氨基酸残基)插人到猪IgG分子的一条重链恒定区(scIgG)内，构建了一新型嵌合体蛋白(Fl-scIgG)，接种猪可产生特异性的中和抗体并诱导淋巴细胞的增生，免疫乳鼠可耐受1000LD50的FMDV攻击。 这种嵌合蛋白的构建将为研制FMD的新型疫苗提供新的思路。,合成多肽疫苗,重组活疫苗基因缺失疫苗,FMDV的L蛋白酶是一种毒力因子，Almeida构建了一种缺失编码前导蛋白L基因的病毒，该病毒对牛和猪无毒力，可作为一种新型活毒疫苗。 FMDV的VPI蛋白上的RGD序列是病毒与细胞吸附所必需的，构建了一种缺失细胞结合位点RGD序列的病毒
14、粒子，免疫牛后，牛产生了明显的抗强毒保护。,A. Berinstein发现，FMDV结构蛋白前体Pl基因构建的重组痘苗病毒免疫牛和小鼠后发现，动物血清中的中和抗体滴度高，抗病毒保护效果好，动物应答较强且持久。 Gregory等利用复制缺陷型的第5型腺病毒构建了包含有FMDV的Pl-2A、3C蛋白前体的编码序列cDNA重组病毒，发现表达的蛋白具有类似病毒空衣壳的功能，以天然构象递呈给免疫识别系统，诱导动物产生高剂量的中和杭体，保护动物抵抗FMDV感染。,重组活疫苗活病毒载体疫苗,核酸疫苗(DNA疫苗),Ward等构建了在巨细胞病毒(CMV)早期启动子调控下，携带有A12-FMDV VPI的DNA
15、疫苗。 Huang等利用猪IgG序列融合蛋白基因构建的DNA疫苗。 Beaxd等采用同样的方法构建了分别携带有完整的、突变的蛋白酶3C和突变的病毒与细胞结合位点的3个DNA质粒。 Wong等利用VPI上第141-160位和第200-213位氨基酸插人到鼠、猪的免疫球蛋白基因制备了DNA疫苗。 Li等人工合成60AA氨基酸的肽段插人猪IgG分子重链恒定区的3端构建DNA疫苗。,保护作用不是很好，可能由于构建的质粒缺乏细胞结合位点。,我国口蹄疫基因工程研究获重大突破,猪口蹄疫O型基因工程疫苗 郑兆鑫教授等把病毒中有免疫原性或免疫功能的基因片段取出，与大肠杆菌的蛋白质结合，使大肠杆菌带有口蹄疫的免疫
16、功能。基因工程疫苗注射后猪体内的抗原与自然感染的抗原不同 。,自然感染动物与免疫动物 鉴别诊断的研究,Why？ 理论依据 结论：利用非结构蛋白抗体区分感染动物和免疫动物。,非 结 构 蛋 白,Cowan等于1966 年发现了FMDV的一种非结构蛋白抗原，研究显示，该抗原仅与受感染的动物血清反应，该抗原被命名为病毒感染相关抗原（virus infectious associated antigen, VIAA）。 基于此原理建立了琼脂糖凝胶免疫扩散试验（AGID），即通过检测动物血清中相应的VIA 抗体存在与否，来鉴别确定该动物曾否接触、感染过活的口蹄疫病毒。,是病毒的RNA聚合酶即病毒基因组的3D区段，是FMDV复制过程中不可缺少的,Scheme of FMDV Genome,自然感染动物与免疫动物 鉴别诊断的研究现状,近十几年来，英、美、荷兰等国学者对FMDV的非结构蛋白(Non-structural protein，NSP-2C、3A、3B、3ABC )等片段作了大量细致的研究，建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)，适用于鉴别诊断感染和注苗动物。 1997 年在荷兰召开的有关学术研讨会上， 与会学者确认用生物工程技术制备的NSP-3ABC 作为抗原的ELISA 方法是区分FMD 感染和注苗动物的理想方法。,
