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1、凝胶渗透层析法,溴酚蓝Kav值的测定,一、什么是凝胶渗透层析法,是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开来的一种层析法,分子筛层析法(molecular sieve chromatography) 排阻层析法（exclusion chromatography）,二、什么是凝胶,凝胶是由一些链状有机物质单体借助共价交联剂在链间形成共价交联使之聚合而成的有机高分子聚合物，其结构为立体网状结构,凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖凝胶（dextran，商品名称为Sephadex ）,
2、葡聚糖凝胶,基本骨架是葡萄糖，葡萄糖通过1，6-糖苷键连接成链状单体，再由3-氯-1，2-环氧丙烷作为交联剂，将链状结构连接成立体网状结构,孔的大小可以通过调节交联剂和葡萄糖的比例，反应条件来控制,交联剂分子越多，交联度越高，网状结构中网络间孔隙的孔径越小,三、原理,将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使之充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶颗粒孔隙的内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，小分子则可以进入凝胶颗粒内部，流速缓慢，最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。,1. 概述,图1 凝胶层析的原理,为了说明凝胶层析
3、的原理，将凝胶装柱，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。实际上Vt是由V0 、Vi 与Vg三部分组成，即：Vt = V0 + Vi + Vg,V0称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”,Vi为内体积（inner volume）又称“内水体 积”,Vg为凝胶本身体积,2. Kd,洗脱体积（Ve，elution volume）与V0及Vi之间的关系可用下式表示：Ve = V0 + Kd Vi,Kd为样品组分在两相间的分配系数。,它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关,它对每一物质是常数，与柱的物理条
4、件无关，可通过实验求得, 当Kd = 0时，则Ve = V0 。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻），洗脱体积等于空隙体积,3. Kd值的三种情况：, 当Kd = 1时，Ve = V0 + Vi 。即小分子完全可以渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内部体积之和, 当 0 Kd 1时，Ve = V0 + Kd Vi。即表示内部体积只有一部分可被组分利用，扩散渗透，Ve 即在V0与Vi之间变化,有时Kd 1 ，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve V0 + Vi,4. Kd测定,Kd可通过实验求得,Ve为实际测得的洗脱体积,Vo可以是不被凝胶滞留的大分子物质的洗脱体积, 如分子量约2
5、00万的兰色葡聚糖-2000,Vi可由干凝胶颗粒重量和吸水量求得：Vi = gWr,Ve的计算: 严格讲，要根据上样量决定,上样体积小时，从加样时算起（上样体积忽略不计）至溶质峰顶止,上样体积中等时，从上样量的一半算起， 上样体积溶质峰顶止,上样体积大时，因洗脱溶质峰出现坪区,上样体积要从加样时算起，至溶质峰前缘最大峰高一半出现为止，此期间所流出的体积为该物质的Ve,Ve I 、Ve II 、VeIII：分别表示三部分样品的洗脱体积。若样品为蓝葡聚糖2000等大分子物质，则Ve I既表示样品的洗脱体积亦表示外水体积Vo。 以- 示洗脱曲线：表示上样量小时洗脱曲线，此时溶质峰峰顶及后缘位置均与上
6、样量较多时不同。,Kav（有效分配系数）,Vt可利用量筒测量简便地得出,Ve与分子量的关系,对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面，Ve与分子量的关系可用下式表示,Ve = K1 K2LogM,选择曲线：以Kav对分子量的对数作图得一曲线,每一类型的化合物都有它自己的特殊的选择曲线。可用以测定未知物的分子量，测定时以使用曲线的直线部分为宜。,四、影响凝胶层析的因素,凝胶的选择,分离程度主要取决于凝胶颗粒内部孔隙的孔径和混合物分子量的分布范围这两个因素,凝胶型号 得水值（Wr克） 交联度 排阻下限 sephadexG-25 2.5
7、5000sephadexG-50 5.0 10000 sephadexG-75 7.5 50000,凝胶粒度对分离效果的影响,凝胶的粒度分为三级：4060目属粗粒；100200目属中粒(细粒)；200400目属细粒(最细粒),中粒应用较多，因为它能使洗脱曲线的峰区变得对称和狭窄。粗粒凝胶能使色带散宽，且彼此重叠。过细的凝胶，因洗脱阻力大，会延长实验时间。,洗脱流速对分离效果的影响,一般流速为30200ml / hr.，即0.53.5ml / min 。流速过快，会使色带变形，影响效果。,流速与洗脱液加在柱上的压力（操作压）。交联度大的（G-10 G-50），流速与压力成正比、与柱长成反比，与柱
8、的直径无关。交联度小的（G-75 G-200），流速与柱的直径有关。 使用恒流泵时，调节流速不可超过其靠重力流速的最大值。,离子强度和pH对分离效果的影响,非水溶性物质的洗脱都采用有机溶剂（如苯、丙酮等）。水溶性物质的洗脱一般用水或具不同离子强度和pH值的缓冲液。,离子强度（或盐类浓度）,洗脱碱性蛋白时，洗脱剂中必须含有一定浓度的无机盐，并随着盐浓度的增加移动加快。但盐浓度过高会使凝胶分子内脱水（占据内体积部分的水丢失），导致凝胶孔径压缩，使流速降低甚至停滞。,许多等电点低于pH7.0的蛋白质的洗脱行为很少受离子强度变化的影响。有时为了使样品溶解而使用含盐的洗脱剂。,盐类的另一个重要的作用是抑
9、制交联葡聚糖和琼脂糖凝胶的吸附性质。,蓝葡聚糖-2000的洗脱，离子强度不得小于0.02，否则易被吸附在柱上，此时可用球蛋白走柱，便可使其解吸（蓝葡聚糖-2000）,洗脱剂中不宜含硼酸盐，因其能同凝胶发生吸附作用。,PH的影响与被分离物的酸碱性有关：酸性pH时，碱性物质易于洗脱；碱性pH时，酸性物质易于洗脱。 各类多糖物质的洗脱以水为最佳。,样品液体积对分离效果的影响,样品液的体积比其浓度更影响分离效果。分析用量1 2 ml %制备用量 20 30 ml %,柱长、直径和分离效果的关系,柱长和直径的比例约为：101 或71。移动缓慢的物质，宜用较长的柱（30401）。 实际所用柱 长：10 1
10、50 cm，直径：1 4 cm 玻璃柱使用前应用二甲基二氯硅烷或甲基纤维素硅化，以免由于“器壁效应”使区带变成凸形。,在实际工作中如何选择凝胶种类，并注意事项为何？,离子交换层析,细胞色素C与牛血清白蛋白的分离,一、什么是离子交换和离子交换层析,离子交换是指液相中的溶质离子和靠静电引力结合在固相载体活性基团上的平衡离子进行可逆地交换过程,一、什么是离子交换和离子交换层析,离子交换层析是用离子交换剂作为固定相，具有不同酸碱性质的物质，它们带有不同性质的电荷或者电荷量不同，在流经固定相时，有的离子能与交换剂以静电引力相结合，有的不能，或者是结合的紧密程度不同，基于电荷不同的不同物质对离子交换剂有不
11、同的亲和力，通过改变洗脱剂离子强度和pH值，控制这种亲和力使这些物质按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来，由此将各组分分开的方法。,二、离子交换剂（ion exchager）,离子交换剂是一类具有活性基团的荷电固相 颗粒 R-SO3-H+ R为惰性载体，不溶于水，多为高分子的聚合物，又称为母体。 SO3-为荷电活性基团，R与SO3-之间以共价键相连，。 H+为平衡离子，与SO3-之间以静电引力相互作用，可被溶液中带相同电荷的离子所置换。,离子交换剂的必备条件,具有不溶性。,能使离子在交换剂的结构中扩散得相当容易， 离子能够自由的进入交换剂而进行交换。,含有相当数目的可交换基团。,有很稳定的化
12、学性质与物理性质。,离子交换剂分类, 根据不溶母体不同，分为三大类：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶（包括葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶）。,根据平衡离子的电荷性质又可分为两大类，即阴离子交换剂和阳离子交换剂。,离子交换树脂,分为强酸型，中强酸型和弱酸型三类,强酸型树脂含有磺酸基团（R-SO3H）,中强酸型树脂含有磷酸根（PO3H2），亚磷酸根（PO2H2）或磷酸基（OPO2H2）,弱酸型树脂含有羧基（COOH）或酚羟基,离子交换树脂,可分为强碱型，中强碱型和弱碱型三类,强碱型树脂为季胺盐N+（CH3）3,中强碱型树脂为既含强碱型基团，也含弱碱性基团的,弱碱型树脂有叔胺N（CH3）2，仲胺N
13、HCH3和伯胺（NH2）类,离子交换纤维素,它具有松散的亲水性网状结构,有较大的表面积，大分子可以自由通过。因此对生物大分子来说，它的交换容量比离子交换树脂大。,离子交换容量是衡量离子交换剂交换能力的重要指标，它是指每单位重量离子交换剂中可解离基团的数量。它是离子交换剂的特性，与操作条件无关。 交换容量常用单位重量（干交换剂g）或单位容积（湿交换剂ml）的交换剂所能交换的毫克当量离子来表示，即毫克当量/克（meq/g）或毫克当量/毫升（meq/ml）。,离子交换纤维素, 分辨率高，分离效果好,纤维素的洗脱条件温和，不影响生物大分子的构型 样品回收率高,同时具有分子筛效应，分辨率进一步提高,葡聚
14、糖凝胶（Sephadex gel）作为离子交换剂母体，再引入不同的交换基团，制成了各种类型的,对生物活性物质是一个十分温和的环境,由于它能引入大量活性基团而骨架不被破坏，交换容量很大,其外形呈球状，装柱后，流动相在柱内流动的阻力较小，流速理想,离子交换葡聚糖凝胶和离子交换琼脂糖凝胶,DEAE-Sephadex A-25 A-50 弱碱性阴离子交换剂 DEAE（二乙基氨基乙基） Cl- DEAE-Sepharose 4-B 6-B 弱碱性阴离子交换剂 DEAE（二乙基氨基乙基） Cl- CM-Sephadex C-25 C-50 弱酸性阳离子交换剂 羧甲基 Na+ CM-Sepharose 4-
15、B 6-B 弱酸性阳离子交换剂 羧甲基 Na+ QAE-Sephadex A-25 A-50 强碱性阴离子交换剂 二乙基（二羧丙基）氨基乙基 Cl- SP-Sephadex C-25 C-50 强酸性阳离子交换剂 磺丙基 Na+,三、离子交换层析全过程,1.带有正性荷电活性基团的结合着平衡离子的阴离子交换剂,2.样品物质将要进入离子交换床，其中含有带正电物质、不带电物质、和带负电物质,3.带负电样品物质逐渐与平衡离子发生置换反应并结合到离子交换剂上而带正电和不带电物质不发生置换反应。,4.离子交换剂与带负电样品物质结合，而中性及带正电物质流出层析床,5.增加洗脱离子的浓度准备取代样品物质。,6.洗脱离子把带负电的样品物质置换下来，使其流出层析床。,四、洗脱,将离子交换剂中结合的带相反电荷的溶质离子（样品离子）洗脱，分布收集洗脱液，即获得带同种电荷的纯物质,增加洗脱缓冲液的离子强度,1. 洗脱方式,四、洗脱,高浓度的洗脱离子可以和样品物质离子竞争交换剂上的结合位点，增加了洗脱离子置换交换剂上结合的样品离子的反应速度,由于取代反应增强，增加了离子交换剂上溶质离子的释放速度。结合强度取决于样品物质离子的带电量，样品离子的带电量越大，样品离子与活性基团结合就越牢固，所需的洗脱离子的浓度就越高。,
