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1、湖南省疾病预防控制中心 地址：长沙市芙蓉中路一段450号1201室（410005） 电话：0731-84305926,湖南省疾病预防控制中心性病艾滋病防治科,江 洋,规范的实验室操作与记录,HIV抗体检测的意义,HIV感染的诊断、疾病进展的监测、抗病毒疗效观察和耐药性监测中至关重要。HIV检测不同于其它病原微生物检测，要求十分严格，任何错误的诊断，包括假阳性或假阴性，都会对被检者产生十分重要的影响。,试剂评估,第四代HIV诊断试剂是一种HIV-1/HIV-2抗体与HIV-1 O亚群抗体及p24抗原的联合检测方法，增加了p24抗原检测，在对第四代试剂的研究中发现p24抗原滴度降低时，血清阳转过程
2、中S/CO值却并未降低，也没有发现第四代试剂检测阴性而第三代试剂检测为阳性的样本。 第四代试剂由于可同时检测抗原和抗体，因而献血员筛查时，建议用第四代试剂进行检测，以尽量提高输血的安全性。,酶联试验,一 实验前期准备工作实验操作实验记录检测报告,实验前期准备工作,目的：是为临床提供准确可靠的实验诊断依据。 我们为了保证实验数据的可靠性，在检验医学中必须坚持全面质量控制（ TQC total quality control ）. 对影响临床检验结果可靠性的各方面因素及各个环节进行质量控制, 全过程质量控制包括实验前、实验中、和实验后三个阶段的质量控制。在实验误差中实验前误差占70%，因而实验前质
3、量保证对减少实验误差显得尤其重要。,试剂准备,ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来在室温下放置30分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。,在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。,样品登记,实验室可根据自己的情况来选择样品登记，样品登记主要使用样品登记本；有条件的实验室使用样品登记软件，不仅可以做样品的记录还可以用来发放检测报告。,HIV
4、抗体检测实验,对于我们常用的ELISA实验大致可以分为以下几个步骤： 1、加样 2、温育 3、加酶标抗体 4、加底物液显色 5、终止反应 6、结果判定,加血清样品的注意事项,移液器的使用,垂直加样 吸头尖端需浸入液面3mm以下 慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度 放液时吸头尖端靠在容器内壁2/3,移液器的使用,反向吸液： 适用于粘稠液体和易挥发的液体 多吸入的液体可以补偿吸头内部的表面吸附，因此定量实验都采用此方法,移液器的维护和保养,每次实验完毕后可用75%的酒精棉球来擦拭，然后用双蒸水将移液器下半部分拆卸清洗、最后置于紫外线照射下进行表面消毒、晾干以备下次使用。,洗涤,洗涤的方式分为机洗和手洗
5、，现在实验室由于都配备了洗板机已基本取代了手工操作， 机洗采用浸泡式 常用于自动洗涤仪器实验中，浸泡时间约为30-60秒 ，洗板条件按试剂盒说明设定。,洗涤,其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量，且不可使用污染过的水源或自来水。,洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离和结合酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技
6、术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按照试剂盒厂家要求来洗涤,温育,温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相的免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。,温育,通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37 30分钟1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37 12小时才能有较完全的结合，低于试剂盒所要求的时间，就可能会影响测定的下限。因此，关于温育，要保证在设定的温度下有足够的反应时间 。,显色,EL
7、ISA试剂的显色液在使用前制备，制备好的显色液要在30分钟内使用，并且要避光保存，如果有没用完的显色液切不可重复使用,比色,加入显色剂以后应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中，比色结果以光密度（oplical density，OD）表达， 临界值（cut off ） 根据试剂盒说明书设定计算公式。,酶标比色仪,酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计，许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要特点有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为1%,酶标仪不应安置在阳
8、光或强光照射下，操作时室温宜在1530，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定，可根据试剂盒说明书的要求进行选择合适的波长进行测定,单波长测定就是选择一个测定波长,直接测定样本的吸光度 双波长测量是采用两个不同的波长,即测定波长(又叫主波长)和参比波长(又叫次波长)同时测定样品的吸光度,以消除一些外在影响因素,提高测定结果的精密度和准确度,实验有效性,比色时应严格按照试剂盒说明书进行操作，每次比色都要设置实验有效性才可进行测定，对不符合有效性的实验进行重复检测！（实验有效性设置见厂家试剂盒说明书）,结果判读,阳性判定值（cut-off ）一般为阴性对照均值加上一个特定的常数，以此作为判
9、断结果阳性或阴性的标准。 用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。 阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。,血清标本的保存,血清标本如果是以无菌操作分离（使用灭菌后的枪头和冻存管），则可以在28下保存一周，如果为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-40以下。,标本的采集工作,使用一次性真空采血管（一管一针），按照采血管规格采集，通常采血量以采血管规格6080%为宜，但要保证拥有足够的标本量用于ELISA实验检测。 真空采血管大致分为： 1肝素纳 2肝素理
10、3促凝管 4血沉管 5 PT管 6血常规管 7分离胶促凝剂 8EDTA-K2，K3，Na2,血清冻存管,往上级确证单位送检时请转管 选择适合的离心冻存管和冻存盒保存血清标本，血清冻存管规格要求： 1、2ML 2、带螺口 3、带内密封圈,血清标本的分离,标本离心前一般会自行凝集，通常放置于室温（2225）3060 min 可自发完全凝集； 使用离心机时应注意平衡和避免液体飞溅，必须等离心机停止工作后才可打开盖板以免发生意外。,溶血,红细胞破裂，血红蛋白逸出导致红细胞溶解，简称溶血。 可由多种理化因素和毒素引起。 在体外，如低渗溶液、机械性强力的振荡、突然低温都可引发。 血红蛋白中含有血红素基团，
11、有类似过氧化物的活性，因此在以标记酶的ELISA测定中，如果血清标本中血红蛋白浓度较高，从而与后面加入的底物反应显色，容易造成假阳性反应。 建议样品采集2小时左右分离出血清,血清标本的保存需要注意的问题,标本要有详细的标识以备查询（包括样品受理号、患者姓名）冰箱和超低温冰箱的温度记录表使用冷冻标签纸填写样品标识,血清标本保存,一、样本的采集及血清分离中要注意尽量 避免细菌污染，长时间存放的标本会导致一些细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；例如一些细菌的内源性酶，会对测定方法产生非特异性干扰。所以在不再进行重复实验时应把标本放置于冷冻保存。,二、冰冻保存的血清标本须注
12、意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。,三、标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。,ELISA试验受诸多因素影响,其中试剂盒的质量以及操作者的水平将直接影响到这一过程的成功与否。因此在完全按照试剂盒要求的前提下，均一，稳定的操作过程和试验条件是获得最佳试验结果的必要条件。,外部质控,HIV抗体检测实验每次实验都要设置一孔外部对照。制备方法: 按一年使用量配置，取HIV抗体阴性血清和阳性血清，56 30分钟灭活，300
13、0转/分离心15分钟，经梯度稀释后用0.2um滤膜过滤除菌。,质控,外部对照质控血清是为了监控检测的重复性和稳定性以及试剂盒批间或孔间差异而由实验室设置的一套对照血清，包括强阳性、弱阳性和阴性对照血清。也可以只设置一个弱阳性对照，以该试剂盒临界值（Cut off）的23倍为宜。,质控,可以根据实验室自身情况采用商用质控品或自制质控品，以下情况必须要做质量控制： 更换试剂批号； 更换检测人员； 更换包装； 更换厂家；,ELISA实验的自身防护,HIV-ELISA实验尽量使用一次性塑胶实验器材，由于玻璃器皿容易造成划伤，建议不要使用。 加样及分离标本时应在生物安全柜内操作，如没有配备生物安全柜的实
14、验室，实验人员操作时可以带口罩和防护眼镜进行个人防护。 实验做完应及时将标本和实验耗材做高压消毒处理。,收样登记表,规范的样品登记应记录详细，包括样品的个人信息，病史，以往检测结果的记录等。HIV血清抗体检测的样品登记主要包括：送检单位、患者姓名、性别、年龄、职业、人群类别、身份证号、家庭地址、收样日期、收样人姓名以及标本状态和检测的结果样品登记本(表),信息采集的重要性,每一份做HIV检测的标本，检测的结果涉及到病人的后续治疗，包括流行病学追踪、免疫功能检测和抗病毒治疗，做好样品登记工作可以避免患者延误治疗。,规范的实验记录,每次做完实验一定要做好实验的记录，对来样的登记要详细规范,实验记录
15、尽量使用A4纸保存,有条件的实验室也可保存电子档案以便于查询,对于筛查实验室所使用的记录表格包括样品登记，试验原始记录，样品送检单，以及筛查报告等都要妥善保存。仪器试用记录和消毒灭菌记录要填写完整。,酶标仪打印结果,仪器使用记录本,常用记录,一 仪器使用记录本 二 废弃物处理记录 三 温度记录表,报告的发放需要注意,认真核对原始记录 报告内容填写要规范 结果的发放要慎重 报告的内容不得随意更改 所出具的报告按照国家统一格式,报告的发放,HIV感染产妇所生婴幼儿检测的要求,（1）婴儿满12个月进行第一次HIV抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测，两种筛查试剂检测结果均为阴性反应，报告“HIV抗体阴性（）”，可排除感染。检测结果出现阳性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均呈阳性反应），不能排除感染，应继续追踪随访，至儿童满18个月时再次进行HIV抗体检测。 （2）婴儿满18个月时应再次进行HIV抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测。两种筛查试剂的检测结果均为阴性反应，报告“HIV抗体阴性,可排除感染。,HIV感染产妇所生儿童HIV抗体检测策略及流程,谢谢！,
