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1、 测序专题 1. 知识荟萃 1.1 测序用引物说明 1.2 测序对样品的要求 2. 测序服务简介 3. 常见问题解答 3.1 常见峰图原因分析及解决方案 3.2 测序答疑 4. 如何订购测序服务 公司简介 南京金斯瑞生物科技有限公司 (原金思特科技 (南京) 有限公司) 创建于2002年，是一家具有全球经营规 模和国际领先地位的生物医药研发外包服务公司。公司总部位于美国新泽西州的Piscataway，并在中国、法国 和日本设有分部。公司客户主要来源于世界级的大规模制药公司、生物技术公司以及全球70多个国家的著名 科研院校。 金斯瑞致力于为从事生命科学研究和早期药物研发的科研人员提供高质量的生物
2、技术外包服务，拥有生 物研究试剂、新药筛选、靶药优化、抗体药物研发等四大服务平台。其一站式生物研究试剂服务平台可为客 户提供基因合成及相关分子生物学服务，多肽合成服务，蛋白表达和纯化服务，抗体服务和细胞系建立等服 务，公司已发展成为具有世界顶级水平的生物CRO公司。 凭借十年基因合成经验的品质保证，金斯瑞已成为全球领先的基因合成供应商，合成生物学研究领域的 领军者。公司自主研发了众多专利性的技术及产品：OptimumGeneTM密码子优化技术， CloneEZ试剂盒， ONE-HOUR WesternTM 试剂盒及THETM Epitope Tag 抗体等。 金斯瑞始终以“提供最好的质量给客户
3、，为客户的利益服务”为理念，与全球客户建立了良好的商业合 作伙伴关系。金斯瑞更肩负着加快人类疾病研究与药物早期研发进程，挽救人类生命的重大使命。 目 录 36 36 39 40 41 41 41 45 . . 常用生物信息学工具 1. 分子生物学/基因设计软件 2. 测序峰图阅读软件 3. 引物设计相关软件 4. siRNA相关软件 5. DNA Star介绍 47 47 47 47 48 . 基因合成专题 1. 知识荟萃 1.1 基因合成vs.基因克隆 1.2 密码子优化 2. 基因合成服务简介 3. 常见问题解答 19 19 20 21 22 . . . . 引物专题 1. 知识荟萃 1.
4、1 引物设计 1.2 PCR设计引物时酶切位点的保护 1.3 引物纯化方式选择指南 2. 引物合成服务简介 3. 常见问题解答 3.1 引物合成及纯化 3.2 引物的定量、保存和溶解 3.3 引物的纯度及使用中的常见问题 3.4 引物的设计及修饰 4. 如何订购引物合成服务 23 23 24 27 29 29 29 30 32 33 35 . . . . . . 目 录 分子克隆实验专题 1. 实验流程 1.1 目的基因获取 1.2 质粒制备 1.3 酶切质粒及目的基因 1.4 目的基因与质粒载体的连接 1.5 感受态细胞的制备及转化 1.6 重组质粒的筛选 1.7 酶切鉴定重组质粒 2. P
5、CR 2.1 影响PCR反应的条件 2.2 常见问题分析及对策 3. 限制性内切酶酶切反应 3.1 常用酶酶切位点 3.2 酶切注意事项 3.3 常见问题及对策 4. 常用试剂、缓冲液配制方法 2 2 2 2 3 3 5 5 7 7 8 13 13 13 14 17 . . . . . . . . . 您的创新药物研发伙伴 分子克隆实验流程图1. 实验流程 1. 目的基因获取 2. 质粒制备 (或购买商业化载体) 3. 酶切质粒及目的基因 4. 目的基因与质粒载体的连接 5. 连接产物转化感受态细胞 6. 重组质粒的筛选 7. 酶切鉴定并测序 1.1 目的基因获取 1) 合成引物 详见引物专题
6、介绍 2) PCR PCR反应的基本成分包括：模板DNA (待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸 (dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。 PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的低温退火 (复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链 的互补序列配对结合； 引物的适温延伸：在Taq酶 (在72左右最佳的活性) 的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与
7、模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。 3) 琼脂糖凝胶电泳检测 取5 l样品+5 l DNA Loading buffer混匀上样，150 V恒压电泳2030 min，保存电泳图片。(琼脂糖凝胶的配制： 1TAE缓冲液+琼脂糖，加热至琼脂糖全部溶解然后冷却至60以下加入EB混匀倒板。其中琼脂糖含量为1 g/100 ml， EB含量为0.1 l/ml) 注：琼脂糖凝胶电泳检测如果有杂带则需切胶回收目的片段。 4) PCR产物纯化 根据PCR产物回收试剂盒的流程回收酶切产物，最后用45 l ddH2O洗脱，-20保存。 1.2 质粒制备 1) 质粒DNA的制备
8、：用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提所要的载体质粒。 2) 或购买商业化载体 1.3 酶切质粒及目的基因 1) PCR产物酶切及纯化 酶切反应； 酶切产物纯化：根据PCR产物回收试剂盒上的流程回收PCR产物，最后用2530 l ddH2O洗脱，-20保存或 进行下一步实验； 琼脂糖凝胶电泳检测，以确保回收到目的片段。 酶切载体及目的基因 EcoRI EcoRI 5 35 3G G A A A A T T T T C C 连接 细胞增殖 载体制备 PCR 目的基因获取 商品化载体 转化重组质粒 - 1 - 2 - 分子克隆实验专题 分子克隆实验专题 您的创新药物研发伙伴 挑取一个单菌落，转到35
9、 ml LB培养基中，于37培养35小时； 将培养液全部转到100 ml LB培养基中培养23小时，到OD6000.30.4. b) 感受态细胞制备步骤 (注意保持低温) 将培养液转入1.5 ml离心管中，在冰上放置1530 min (满管)； 4 4000 rpm离心2 min，弃上清； 加入0.8 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2，重新悬浮沉淀； 4 4000 rpm离心2 min，弃上清； 加入0.2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2 (含15%甘油)，重新悬浮沉淀，得到感受态细胞； 上述感受态细胞可以立即用于转化；也可在-80超低温冰箱中长期保存备用。 2) 连接产物转
10、化感受态细胞 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克 隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。 转化原理：感受态细菌与质粒冰浴后在较高温度下短时间水浴 (热激)，之后再冰浴，由于细菌细胞经受温度骤变，磷脂 双分子层状态发生改变，对外源DNA的通透性增加，质粒可以高效地进入细菌细胞。 影响转化率的因素 细胞生长状态和密度 转化的质粒 DNA 的质量和浓度 试剂的质量 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染 实验原理： (1) 热激法：大肠杆菌在0 CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗D
11、Nase的羟基钙磷酸 复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细 胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 (2) 电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于 DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。 (1) 热激法转化实验步骤 制备选择性培养基平板：在融化的250 ml LA培养基中加入250 l Amp (100 mg/ml)，250 l X-gal (20 mg/ml)，
12、 25 l IPTG (200 mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中； 取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 每100 l感受态细胞加入约20 ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA (阳性对照) 及不加入任 何DNA (阴性对照)，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟； 热击：将离心管放置42水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管； 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置12 min； 复苏：每管加400 l SOC培养基，在37摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏； 布皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素 (Amp) 的LA平板； 培养：倒置培养皿
13、，于37培养1216小时即可观察到蓝白相间的菌落 (其中白色菌落为含有外源插入片段的转 化子，蓝色菌落是载体自连的转化子) （2）质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 制备选择性培养基平板：在融化的250 ml LA培养基中加入250 l Amp (100 mg/ml)，250 l X-gal (20 mg/ml)， 25 l IPTG (200 mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中； 取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 2) 载体酶切及纯化 酶切反应； 琼脂糖凝胶电泳检测 (取200 ng左右没有酶切的质粒做对照)； 酶切产物纯化：根据PCR产物回收试剂盒上的流程回收酶切产物，最后用20
14、30 l ddH2O洗脱，-20保存或进 行下一步实验。 1.4 目的基因与质粒载体的连接 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有如下几种： 1) 带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这也是最容易克隆的 DNA片段，一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源 DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端 人为加上不同酶切位点以便与载体相连。 2) 带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一
15、种酶消化，亦得到同样 的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，而 且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA 的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最 高水平。还可将载体DNA的5磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5端磷酸的外源 DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E. coli受体菌后的扩增过程中 缺口可自动修复。 3) 带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性 末
16、端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓 度的聚乙二醇 (PEG 8000) 以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。 特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末 端接上合适的接头 (linker) 或衔接头 (adapter) 使其匹配，也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶的klenow大片段部分 填平3凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 注意事项： 1) DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10100 倍。 2) 在连接带有粘性末端的DNA片段时
