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1、第五章,细菌检验技术,第一节,细菌形态检验技术,一、细菌染色标本镜检（一）染色标本检查的基本程序1、涂片2、干燥3、固定4、染色染料种类：碱性染料、酸性染料、中性染 料，碱性染料最常用,（1）单染法用一种染料进行染色，可观察细菌的大小、形态和排列，但不能用于鉴别细菌。如：亚甲蓝染色法 （2）复染法用两种或两种以上的染料进行染色，不仅可以观察细菌的大小、形态和排列。还可用于鉴别细菌，又称为鉴别染色。 鉴别染色革兰染色抗酸染色,复染法的一般步骤初染媒染脱色复染,5、镜检显微镜：光学显微镜 所用放大倍数：101001000 所用镜头：油镜头 镜油：香柏油或石蜡油 香柏油折光率（n1.515）与玻片折
2、光率 （n1.52）接近 显微镜使用完毕须擦拭镜头。,（二）革兰染色法1、染液组成：结晶紫染液、卢戈碘液、95乙醇、稀释复红,2、染色方法 标本涂片，固定结晶紫初染 （1分钟） 碘液媒染（1分钟） 95%乙醇脱色（30秒） 复红复染（3-5分钟） ,3、染色结果兰阳性菌（G+）紫色； 革兰阴性菌 (G-) 红色。,4、染色原理 （1）渗透学说：与肽聚糖结构有关G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细
3、胞壁，复红复染后呈红色。,（2）化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关（3）等电点学说：与细菌所带电荷有关,5、临床意义鉴别细菌 选择用药 理解细菌的致病作用,6、影响因素（1）操作因素 涂片的厚薄 脱色时间的长短（2）染液因素 卢戈碘液放置时间过长 95乙醇挥发 结晶紫与草酸铵混合时间太长（3）细菌因素： 细菌种类、 细菌菌龄,（三）抗酸染色法用于鉴别抗酸杆菌和非抗酸杆菌步骤：1、苯酚复红加温染色2、盐酸酒精脱色3、亚甲蓝复染 结果：抗酸杆菌为红色非抗酸杆菌为蓝色,（四）其他染色法1、特殊结构染色法,2、负染色法,3、荧光染色,二、细菌不染色标本镜检应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式
4、常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法,压滴法,悬滴法,镜检,3、暗视野聚光法4、相差显微镜检查法,（二）影响因素1、操作因素 2、玻片因素 3、光线强度,第二节细菌接种与培养技术,一、基本条件 （一）接种环与接种针用于取菌、接种及分离细菌的器具1、接种针用于挑去单个菌落、穿刺接种及斜面接种2、接种环用于划线分离培养、纯种接种、挑取菌落和菌液以及制备细菌涂片。3、接种前后都应对接种环和接种针进行灭菌,（二）红外接种环灭菌器利用红外线产热进行灭菌,（三）培养皿制备固体培养基常用的器皿，用于细菌的分离培养。,附：微生物检验常用玻璃仪器的准备1、玻璃器材的种类及用途2、玻璃器皿灭菌前的准备玻璃器皿在
5、清洗、干燥后必须经正确的包裹和加塞后才能进行灭菌处理。,3、玻璃器材的清洗 新购置的玻璃器材：12盐酸浸泡清水清洗 用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷清水清洗细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷 盛培养基试管和平皿：高压灭菌趁热倒出洗涤剂洗刷清水冲洗 吸管：3来苏浸泡清水冲洗 玻片和盖玻片：3来苏和清洁液浸泡清水冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗涤 含油脂的器皿：单独灭菌,（四）培养箱1、电热恒温培养箱2、二氧化碳培养箱3、厌氧培养箱,（五）培养基培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。1、培养基的成分及作用 营养物质：肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无
6、机盐 水 凝固剂：琼脂、明胶 抑制剂 指示剂,2、培养基的种类 （1）按培养基的物理性状分类液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。 半固体培养基：含0.30.5琼脂，用于观察细菌的动力。 固体培养基：含22.5琼脂，多用于细菌的分离培养。,（2）按培养基的用途分类 基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培养基（KIA） 选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目的菌，如SS平板 增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。 厌氧培养基：
7、用于培养厌氧菌,3、培养基制备的一般程序,调配,溶化,矫正pH,过滤澄清,分装,灭菌,检定,培养基灭菌, 基础培养基：121高压蒸汽灭菌15分钟, 含糖培养基：113 灭菌15分钟, 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次, 不耐高温的液体成分：滤过除菌,保存,二、细菌接种与培养技术 （一）无菌技术 1、细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。 2、无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。 3、细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌 4、无菌试管、烧瓶、吸管的使用 5、标本的采集 6、废弃物的处理 8、个人防护,（二）细菌接种与分离技术 1、细菌接种的基本程序,灭菌接种环,沾取标本,接种,灭菌接种
8、环,杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本,杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境,2、细菌接种法 （1）平板划线接种法：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。方法：1）分区划线法：适用于含菌量较多的标本2）连续划线法：适用于含菌量较少的标本,分区划线法,第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,连续划线法,（2）液体培养基接种法 （3）穿刺接种法 :用于观察细菌动力 （4）斜面接种法 （5）倾注培养法:用于细菌计数 （6）涂布接种法：见于药敏试验,（三）细菌的培养方法 一般培养（需氧培养）： 培养温度：35（采用恒温培养箱） 培养时间：1824h
9、 二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱、化学法 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等,三、细菌的生长现象 （一）细菌在液体培养基中的生长现象,混浊 沉淀：多见于链状排列的细菌 菌膜：多见于厌氧菌,细菌在液体培养基中的生长现象,（二）细菌在半固体培养基中的生长现象,有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。 无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。,细菌在半固体培养基中的生长现象,有动力现象,无动力 现象,（三）细菌在固体培养基中的生长现象,菌落 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。 菌落特征：大小、形状、边
10、缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性 菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M） 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。,菌 落,菌落与菌苔,第三节细菌生化鉴定技术,细菌的生化反应：细菌具有各自独特的酶系统，因而在代谢过程中对底物的分解能力不同，所产生的代谢产物也不同，这些代谢产物各具有不同的生物化学特点，利用生物化学的方法来检验这些代谢产物，可用于鉴别和鉴定细菌，这种用生化反应测定方法称为细菌的生化反应。,一、碳水化合物的代谢试验,糖发酵试验 葡萄糖氧化发酵试验（O/F试验） 甲基红试验 V-P试验 七叶苷水解试验 半乳糖苷渗透酶试验,（一）糖发酵试验,原理：不同细菌可
11、分解不同的糖多糖单糖丙酮酸酸性产物(或产酸产气)pH 指示剂呈酸性变色(若产气者有气泡出现) 培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微量发酵管 试剂：酚红、溴甲酚紫等 结果:培养基呈酸性变色（红 黄） 应用：观察细菌对糖的分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定,糖发酵试验结果判断,糖发酵试验,（二）葡萄糖氧化/发酵试验1、原理：细菌分解葡萄糖的过程中对氧的需求不同，分为氧化、发酵和产碱三型单糖丙酮酸酸性产物pH 指示剂呈酸性变色2、培养基：HL葡萄糖培养基3、试剂：石蜡4、结果：两管均不变色：产碱型石蜡管变色：发酵型非石蜡管变色：氧化型5、应用：肠杆菌和非发酵菌的鉴别,（三）甲基红试验,原理：细菌分解糖，产
12、生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4以下，加入甲基红（4.4-5.4）后，使甲基红呈现红色反应。此为甲基红试验阳性。 培养基：葡萄糖蛋白胨水 试剂：甲基红试剂 结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+培养基不变色： 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌,葡萄糖,丙酮酸,大量混合酸,pH降至4.4以下,甲基红试剂,培养基变红,甲基红试验,甲基红试验,（四）伏普试验（V-P试验）,原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化合物。 培养基：葡萄
13、糖蛋白胨水 结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+培养基不变色： 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌,葡萄糖,丙酮酸,乙酰甲基甲醇,二乙酰,V-P试剂,培养基变红,VP试验,脱酸,葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径,葡萄糖,丙酮酸,大量混合酸,pH降至4.4以下,甲基红试剂,培养基变红,乙酰甲基甲醇,二乙酰,V-P试剂,培养基变红,脱酸,（五）B-半乳糖苷酶试验1、原理：有些细菌产生的B-半乳糖苷酶可分 解邻硝基酚B-半乳糖苷（ONPG）产生邻硝基苯酚（黄色） 2、培养基：1%乳糖肉汤琼脂 3、试剂：甲苯、 ONPG 4、结果：加入ONPG后，菌悬液黄色：+菌
14、悬液无色：- 5、应用：迟缓发酵乳糖细菌的快速检测,（六）七叶苷水解试验 1、原理：某些细菌可以分解七叶苷七叶苷 葡萄糖+七叶素 黑色沉淀 2、培养基：七叶苷培养基 3、结果： 培养基黑色：+培养基不变色：- 4、应用：D群链球菌和其他链球菌的鉴别,Fe2+,二、蛋白质类代谢试验,靛基质试验 硫化氢试验 尿素酶试验 苯丙氨酸脱氨试验 氨基酸脱羧酶试验,（一）靛基质试验,原理：细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。 培养基：蛋白胨水 试剂：靛基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛） 结果：加入试剂后，培养基出现红色液面：+ 培养
15、基液面为黄色： 应用：用于肠道杆菌的鉴定,靛基质试验原理,色氨酸酶,色氨酸,靛基质 （吲哚）,玫瑰靛基质 （玫瑰吲哚）,对二甲基氨基苯甲醛,靛基质试验,（二）硫化氢试验,原理：细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐或铅盐结合生成黑色络合物。 培养基：含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基 结果：培养基变黑：阳性不变黑：阴性 应用：常用于肠道杆菌的鉴定,（三）尿素酶试验,原理：产生脲酶的细菌，能水解尿素生成氨和CO2，氨使培养基呈碱性变色。 培养基：尿素培养基 试剂：酚红指示剂 结果：培养基变红：+培养基不变色 应用：肠杆菌科属间鉴定,尿素酶试验原理,尿素,尿素酶,氨+CO2,培养
16、基pH升高,酚红呈碱性变色（红）,(四)苯丙氨酸脱氨实验,原理：细菌的具有的苯丙氨酸脱氨酶，可使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯丙酮酸，后者与三氯化铁作用，形成绿色化合物。 培养基：苯丙氨酸琼脂 试剂：10三氯化铁 结果：加入试剂后培养基呈现绿色为阳性 应用：多用于肠道杆菌的鉴定,苯丙氨酸脱氨试验原理,苯丙氨酸,苯丙氨酸脱氨酶,苯丙酮酸,10三氯化铁,绿色化合物,（五）氨基酸脱羧酶试验 1、原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶，可使氨基酸脱羧成胺和二氧化碳，胺溶于水使培养基显碱性 2、培养基：氨基酸脱羧酶培养基（糖、氨基酸） 3、指示剂：为溴甲酚紫5.2（黄）-6.8（紫） 4、结果：培养基变紫色：+培养基为黄色：- 5、应用：肠杆菌科细菌的鉴别,
