《细胞生物学研究思路——基础医学 2016-9-16》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞生物学研究思路——基础医学 2016-9-16（69页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、西安交通大学医学部 2016.9.16,细胞生物学与遗传学研究思路,黄 辰,细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组成员,黄辰 教授 博士,侯妮讲师博士,刘利英 高级实验师 博士,杨娟副教授博士,陈妍珂 副教授 博士,赵凌宇 讲师 博士,刘颖勋讲师 博士,秦棪楠讲师 博士,郭波 讲师 博士,王鲁敏讲师 博士,王晓霏实验室 硕士,细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究平台,实验室建设模块,大型仪器检测室,普通功能实验室,动物饲养室,形态学检测,细胞生物学,分子生物学,流式细胞仪,激光共聚 焦显微镜,图像分析系统,定量PCR,膜片钳,蛋白组学,芯片点样 杂交系统,激光捕获显 微切割系统,小动物活 体成像系统
2、,动物行为学,细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组实验环境,技术集成（开设高端生物医学实验课程）一站式的科研基地（实现功能实验室与大型仪器联动）严格管理与人性化统一宽松学术氛围与严谨科学态度,细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向,心理应激与疾病,建立了恐惧声音心理应激模型探索了心理应激与肿瘤发生关系探索了心理应激对学习记忆的生物学效应探索了心理应激对雄性生殖的生物学效应,细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向,2.肿瘤发生发展机制,非编码RNA与肿瘤的关系肿瘤的表观遗传学调控机制（MECP2）RNA结合蛋白、mRNA与非编码RNA的相互作用在肿瘤中的网络调控,细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组
3、研究方向,3.生物标志物筛选,肿瘤血清标志物的筛选自闭症血清标志物的筛选高原习服标志物的筛选,细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向,4.糖修饰组学在疾病中的作用,肿瘤糖修饰组学自闭症糖修饰组学高原习服糖修饰组学,科学研究是科学工作者的幸福源泉,幸福就在于人的感性生活，在于感性欲望的满足与快乐。 幸福的过程有神经递质的释放（多巴胺与内啡肽）。 科学研究的幸福可以自我掌控。,为什么科学研究是一种痛苦？,课题死了么？1. 结论已经发表2. 推理已经证实3. 技术已经应用4. 实验无法实现5. 时间不够用,发散思维,从科学的痛苦到科学的幸福的基础,如何将科学研究的痛苦变成幸福？,跟踪性研究思路,横
4、向移植的研究,纵向连接的研究,A,B,E,A,C,E,A,D,E,A,B,源头,跟踪模仿,B,C,源头,跟踪模仿,A,B,C,将科学研究变得简单,研究思路跟踪性研究思路,发现某基因在肝癌组织中表达增高，并有很多机制,研究样本差异,查文献后，确定在乳腺癌中尚无人涉及。SCI处女作出炉：某基因在乳腺癌组织中表达增高。,已发表内容,自身研究内容,研究思路跟踪性研究思路,发现辛伐他汀有某种作用，能够治疗某种临床疾病，且对其原理进行了研究，找到了相关基因。,药物处理差异,联想到了阿托伐他汀。SCI处女作出炉：阿托伐他汀对某疾病的治疗效果及其作用机制。,已发表内容,自身研究内容,研究思路跟踪性研究思路,发
5、现某基因具有抗氧化应激的作用,机制相似性,联想到氧化应激在好多疾病的病理机制中都发挥作用，比如糖尿病肾病、糖尿病神经病变等等。SCI处女作出炉：某基因在糖尿病肾病中的作用。,已发表内容,自身研究内容,研究思路跟踪性研究思路,发现A基因具有某种作用。,信号通路,联想到A基因的上游或下游基因是B基因，是否也有这种作用？SCI处女作出炉：B基因具有某种作用。,已发表内容,自身研究内容,研究思路跟踪性研究思路,问题1：肿瘤的表观调控,研究思路跟踪性研究思路,问题2：MeCP2在胃癌中的作用如何？,研究思路跟踪性研究思路,问题3：什么分子调控了MeCP2？,研究思路跟踪性研究思路,问题4：MeCP2调控
6、了什么分子？,染色质免疫共沉淀(CHIP-on-chip),研究思路跟踪性研究思路,假设与结果,研究思路跟踪性研究思路,发现某种药物能够对TNF-产生影响。,家族基因,拜读大作后，联想到IL-6以及CRP都是炎症因子，有可能这种药物对IL-6以及CRP也有影响。SCI处女作出炉：某种药物对IL-6以及CRP的影响。,已发表内容,自身研究内容,研究思路基于技术跟踪的新探索,各种组学,不同样本,不同处理,生物信息分析,靶分子验证,问题的解释,研究思路基于技术跟踪的新探索,收集临床样本,RNA,DNA,Protein,microRNA芯片,基因芯片,组织芯片,RT-PCR或Real-time PCR
7、,Western-blot,免疫组化,基因表达差异,确定目的基因,参考文献,microRNA研究,研究思路基于技术跟踪的新探索,问题1：自闭症诊断困难,研究思路基于技术跟踪的新探索,问题2：自闭症的遗传因素复杂,研究思路基于技术跟踪的新探索,问题3：为什么自闭症有共同的特征？,研究思路基于技术跟踪的新探索,问题4：如何寻找自闭症的生物标志物？,生物芯片或磁珠,化学芯片或磁珠,疏水芯片,阳离子交换,金属芯片,亲水芯片,抗原- 抗体,受体-配体,DNA-Protein,阴离子交换,PS10 or PS20,Choose disease,Both tumor patients and health
8、controls,Collecting samples,serum,Sample quality is very importantBlood samples were collected by trained phlebotomist, and processed within a few hours according to a standard protocol. Aliquots of sera for mass spectrometric analysis were frozen at -80 immediately after processing.,Separation prot
9、eins by The liquid chip,Mass spectrum analysis,表1 串联质谱鉴定的可能的ASD相关蛋白,研究结果,新的问题或未解决的问题,所有技术为我所用,研究思路基于新现象观察下的新探索,基因功能的分析,基因功能研究,目的基因表达调控,细胞水平,动物水平,活性,周期,运动,分化,衰老,凋亡,.,模式动物,药物处理,临床样本收集,组织水平,动物组织,稳定细胞系,药物处理,成瘤实验,.,免疫组化,qPCR,WB,.,按照论文结构的实验设计,分子准备工作、前期初步实验结果引入,细胞/组织水平现象作用机制切入,作用机制深入,可选： 模式细胞/动物验证 旁通机制 临床样
10、本验证 模式图 Diagram,qPCR,WB,WB,WB,RNAi,IF,FCM,IHC,Drugs,Morphology,基因突变与沉默技术RNAi,1990年，Jorgensen将色素的基因导入矮牵牛(petunias) ，发现了共抑制现象 (cosuppression)。 1995年，Guo等应用par I基因的反义RNA处理线虫产生了par I 基因功能缺失型或基因敲除型的表型。 1998年，Fire 和 Mello 证实Guo发现的正义RNA或反义RNA诱导基因表达抑制是由微量dsRNA 而引起。提出RNA干涉(RNA interference, RNAi)的概念。,基因突变与沉默
11、技术RNAi,Double-stranded RNA,inject,C. elegans,Neg. control Uninjected,Antisense RNA dsRNA,sense,antisense,Nature 1998 391:806-811,Mex-3 mRNA detection in embryosby in situ hybridization,Andrew Z. Fire (Stanford University photo),Craig C. Mello (University of Massachusetts Medical School ),基因突变与沉默技术RN
12、Ai,dsRNA,22nt siRNAs,target mRNA,secondary siRNAs,amplification,processing,degradation,recognition,copying,+,processing,spreading,基因突变与沉默技术RNAi,基因突变与沉默技术RNAi,Initiation Step,ATP,ATP,ADP + ppi,ADP + ppi,DICER,KINASE,RdRP,Dicer,siRNA,5,3,5,3,RISC,Effector Step,siRNA binding siRNA unwinding RISC activa
13、tion,基因突变与沉默技术RNAi,研究案例,小英家系,小英的心电图,显性负效应,基因突变与沉默技术RNAi,研究案例,基因突变与沉默技术RNAi,研究案例,基因突变与沉默技术RNAi,研究案例,基因突变与沉默技术RNAi,研究案例,Heart Rhythm. 2013, 10（1）：128136,基因突变、敲除与沉默技术ZFNs技术,锌指核酸酶是锌指蛋白和FokI核酸内切酶的剪切结构域组成的嵌合融合蛋白, 其锌指蛋白结构域负责识别靶位点, 依赖FokI的作用打断DNA双链, 从而造成双链断裂，断开的双链DNA在修复过程中会发生碱基的缺失、插入、同源交换等突变。,基因突变、敲除与沉默技术ZF
14、Ns技术,锌指核酸酶：,锌指蛋白,Fokl,+,识别区域,酶切区域,靶点选择受限。 “上下文效应” 。 Off-targeting现象严重 。 ZFNs 的合成组装技术难度大。,基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术,2009 年，Boch等和Moscou等破解黄单胞菌效应子蛋白 TALE（transcription activator-like effectors）与寄主靶基因 DNA特异性识别分子密码。 2011年Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALENs技术进行了基因组靶向修饰相关研究。,基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术,TALE n
15、uclease结构,DNA识别区（TALE蛋白）：TALE蛋白是由植物病原体黄单胞菌属分泌的一种蛋白,能特异性的识别并结合 DNA 序列。,剪切结构域（Fokl）：Fokl则可通过二聚化产生核酸内切酶活性, 在该序列附近造成 DNA 的双链断裂(Double-stand break, DSB)。,基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术,TALE蛋白,TALE蛋白是由12个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。 每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基位点（Repeat Variant Di-residue, RVD） 。 每个蛋白模块上RVDs对应识别一个碱基。,基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术,Fokl 核酸内切酶,TALENs,ZFNs,
