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1、生物技术制药4,第四章 抗 体 制 药,第一节 概述,1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开创了抗体制药。 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白，、球蛋白，并证明抗体活性主要存在于球蛋白组分。,第一节 概述,抗体（antibody,Ab）是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。 抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。即B细胞浆细胞球蛋白,（1）抗体与免疫球蛋白,20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白， 统称为
2、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。 所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念。,（2）多克隆抗体与单克隆抗体,多克隆抗体（polyclonal antiboty, PcAb）：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。,1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonal antibody McAb）。 单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的发展。,单克隆抗体的应用：,单克隆抗体作为
3、抗体制剂，在临床上主要用于疾病的诊断和治疗。 单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。,单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。 以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。,免疫导向疗法的障碍与改造,鼠源性、分子量大 降低免疫源性、降低分子量,第二节 单克隆抗体,单克隆抗体：将抗体产生细胞（B淋巴细胞）与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的抗体。 针对一个抗原决定簇、单一B细胞克隆产生、结构和特异性完全相同、高纯度。,
4、抗 原,小鼠/大鼠,脾 脏,B淋巴细胞,淋巴细胞,骨髓瘤细胞,多克隆,单克隆,第二节 单克隆抗体抗原与动物免疫,1、制备抗原动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。 有的抗原可以用化学合成：地高辛,2、抗原的制备与纯化 多数抗原物为混合物，须经免疫、筛选、克隆化。 3、免疫动物品系与骨髓瘤细胞品系 骨髓瘤细胞来源：BALB/c小鼠、Lou大鼠,骨髓瘤细胞系 全 名 简称 来源 耐受 表达自身Ig分子 p3-X63-Ag8 X63 BALB/c 8-Ag Ig-r1. MOPC11-X45-6TG X45 BALB/c 6-TG Ig-r2b p3
5、-NS1-Ag4.1 NS-1 BALB/c 8-Ag （非分泌型） p3-X63-Ag8.653 P3.653 BALB/c 8-Ag SP2/0-Ag14 SP2/0 BALB/c 8-Ag Fast-Zero FO BLAB/c 8-Ag Y3-Ag1,2,3 Y3 Lou 8-Ag 链 YB2-3.0-Ag20 YB2 (LouAO)F1 8-Ag ,免疫方法：体内、体外,1、体内免疫法：适合免疫性强、抗原量较多、8-12周龄雌鼠。 颗粒性抗原：S.C 107个细胞初次免疫，1-3W免疫1-2次； 可溶性抗原：10-100g（Ag）+等量福氏完全佐剂（S.C），2-4W/1-2次（不加
6、佐剂） 采集脾细胞前3d iv最后一次抗原（刺激B细胞分裂） 脾内免疫法：Ag 0.1-0.2ml，105/10g（追加免疫）,2、体外免疫：不能用体内方法或抗原免疫原性极弱且引起免疫抑制时。 抗原量少（10g）、免疫期短（4-5d）、干扰因素少、杂交瘤细胞株不稳定。 4-8W BALB/c小鼠脾脏制成细胞悬液，加Ag达0.5-5g/ml，培养4-5d（370C、5%CO2），分离脾细胞，细胞融合。,淋巴细胞 （致敏动物脾细胞）,骨髓瘤细胞 （腹水癌型浆细胞）,融 合 处 理,BALB/c小鼠,培养液含单克隆抗体,腹水中含单克隆抗体,选择融合细胞 培养杂交瘤细胞,杂交瘤细胞克隆化,第二节 单克
7、隆抗体 细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养,脾细胞 1108,骨髓瘤细胞 21073107,PEG：40%-50% 4000，2min,DMSO,+培养液稀释PEG,融合率高 自身不分泌抗体 杂交瘤细胞分泌抗体强而稳定,脾脾,脾瘤,瘤瘤,HAT/7d,瘤细胞,HT/7-14d,RPMI1640,抗体阳性检测 （8-9天）,小鼠腹腔巨噬细胞 脾细胞 胸腺细胞,HAT培养液 RPMI1640培养液 成分 浓 度 成分 含量H 1.010-4mol/L RPMI1640粉 10.4gA 4.010-7mol/L HEPES 2.4gT 1.610-5mol/L L-谷氨酰胺 0.3g青霉素、链霉素 各1
8、0万U水 1000ml,pH=7.4，过滤、除菌,H（次黄嘌呤） A (氨甲喋呤，阻断DNA合成) T (胸腺嘧啶),第二节 单克隆抗体 筛选阳性克隆与克隆化,1、筛选 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术 2、克隆化：是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。 有限稀释法：HT培养液/饲养细胞 软琼脂法：0.5%琼脂糖凝胶/易成功,第二节 单克隆抗体 杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定,1、染色体分析：是鉴定的客观指标，了解分泌抗体的能力。数目多、集中（稳定高效价） 2、McAb的Ig类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。 3、亲和力测定 4、特异
9、性、纯度、识别抗原的相对分子量等,第二节 单克隆抗体 McAb的大量制备,体内培养法：5-20mg/ml （1）1-2W前BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷（pristane） （2）7-12d抽腹水，离心，保留上清,体外培养法：10g/ml （RPMT1640液培养） （1）加10%-20%胎牛或小牛血清（ 100g/ml ） （2）无血清培养：白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等 （3）悬浮培养（2107）（ 400g/ml ）与微载体悬浮培养（108）,第二节 单克隆抗体McAb的纯化,确定McAb的Ig类型和亚型 体外诊断试剂：IgG（沉淀+亲和层析）、IgM（沉淀+凝胶过滤） 体
10、内诊断试剂或治疗用药：去除内毒素、病毒、核酸等（亲和层析、离子交换层析等）,第二节 单克隆抗体McAb的纯化,1、澄清和沉淀处理,1000g/5min（除沉淀物）,20000g/30min（小颗粒）,0.2m滤膜（除细菌等）,饱和硫酸胺沉淀抗体,50%饱和硫酸胺回收抗体,2、分离 凝胶过滤：Sephadex G200为介质，最高峰IgM，另两峰IgG，收率50-80%，纯度90%以上。 阴离子交换：IgG类，pH5.5除杂蛋白， pH7.4时IgG1、IgG2结合于层析柱，低离子强度IgG2a洗脱， IgG2b、IgG3沉淀。 亲和层析：IgG类，pH8.0（IgG2b、IgG3结合在蛋白A柱
11、，IgG1稍差），pH3.5洗脱IgG2b， pH4.0洗脱IgG3，pH4.5洗脱IgG2a，pH6.0洗脱IgG1。,总之，应依据单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。体内诱生法单克隆抗体的纯化方法： 1、离心（取上清）、超滤、盐析 2、分离 凝胶过滤（IgG、IgM单抗纯化） 阴离子交换层析（IgG单抗纯化） 亲和层析（IgG单抗纯化）,第三节 鼠源性单克隆抗体的改造,杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用，必须对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。 目的：降低免疫源性；降低相对分子量，增加组织通透性。 人-鼠嵌合抗体、改形抗体 、小分子抗体。,类型 基本结构 相对分子
12、量 人-鼠嵌合抗体 人IgC-小鼠IgV 150000 改形抗体 小鼠CDRs替换人CDRs 150000 Fab 完整L链和Fd 50000 FV VH和VL 25000 单链抗体（SCFV） VH-多肽-VL 27000 单域抗体 VH或VL 12500 最小识别单位（MRU） 一个CDR 2000,一、人-鼠嵌合抗体 抗原抗体结合功能抗体可变区（V）同种性免疫源性抗体稳定区（C） 在基因水平上将鼠源单抗的H 和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H 和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H 和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。,二、改形抗体（CDR移植抗
13、体） Ig 分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。 H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。 用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性，可消除免疫源性。,将鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig的CDR序列CDR移植抗体 用与鼠对应部分有较大同源性的人框架区替换鼠框架区模板替换,对鼠CDR及框架区表面残基进行镶饰或重塑表面重塑 改变人框架区与CDR有相互作用、与抗体亲和力有关或对框架区空间结构起关键作用的残基补偿替换 保留鼠源性抗体可变区中参与抗原结合的残基，或CDR与框架区中的关键残基定位保留,三、小分子抗体 基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的V区片段，相对分子量为原抗体的1/801/3。即保留CDR区，而Ig 分子中的C区不表达。,小分子抗体类型有：,Fab片段抗体；Fv抗体；单链抗体；单域抗体；最小识别单位,单链抗体的优点：,可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。 易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度。 相对分子量小，免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应，能延长T1/2。,
