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1、第三篇 基因信息的传递,第 十 章 DNA的生物合成（复制） 第十一章 转录 第十二章 翻译 第十三章 基因表达调控,中心法则,基因：是为生物活性产物编码的DNA功能片段，这些产物主要是蛋白质或是各种RNA,第十章 DNA的生物合成（复制）,复制的要点 1 半保留复制 2 有起始点、终止点和方向 3 半不连续复制,第一节 半保留复制,半保留复制：当细胞分裂, DNA进行复制时，双螺旋结构解开而成为单链，用于合成新的互补链。子代细胞出现新的DNA双链，其中一股单链是从亲代完整地接受过来的旧链。另一股单链完全重新合成的新链，且按碱基配对原则与旧链互补。,1、Watson和Crick的半保留复制模型
2、：DNA双螺旋的两条链碱基通过A-T、G-C之间的氢键联结，并且两条链互补。因此，Watson和Crick提出DNA的半保留复制模型（p.407，图34-1）：双螺旋揭开，每条链作为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，在依赖于DNA的DNA聚合酶催化下，按照A-T、G-C配对方式，合成与两条模板链脱氧核苷酸对应的两条新链，然后以一新一旧脱氧多核苷酸组成的双链分别进入子细胞。,2、模型的试验证明：1958年Meselson和Stahl用密度梯度离心法结合同位素标记法进行证明试验：（1）将大肠杆菌在含标记的15NH4Cl的培养基内，繁殖12代，保证DNA上的N都是15N；（2）将上述培养
3、好的细菌转入到含14NH4Cl的培养基中继续培养，并在细菌刚转入14NH4Cl中（0代）以及在此培养基中分裂1、2、3、4代时分别取样分析；,（3）DNA用密度梯度平衡离心法进行高速长时间离心，由于15N-DNA的比重大于14N-DNA，在氯化铯溶液中离心时分别处在不同密度的层次中（重在下，轻在上），结果：0代：两条单链全为重的（处于下层）；1代：全部为一轻一重的杂合分子（处于上层和下层之间一个单层）；2代：一种是15N-14N，与第1代的一样；另一种是全部轻的14N-14N。为11；3代：仍有两种分子，但14N-14N增多，为13；4代：两者比为17。,DNA半保留复制的证据,3、意义：DN
4、A在代谢上的稳定保证了遗传信息的稳定性。,第二节 DNA复制的酶学,1.底物：dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2.聚合酶：DNA聚合酶（DNA依赖的DNA 聚合酶) DNA-pol 3.模板：单链的DNA母链 4.引物：寡核苷酸引物（RNA) 5.其他酶和蛋白质因子：解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶,DNA聚合酶的活性,5至3的聚合活性 5 3方向 核酸 外切酶活性 5 3外切酶活性 3 5外切酶活性,一、聚合酶催化的反应,5至3的聚合活性（ 5 3 ）,核酸外切酶活性35外切酶活性53外切酶活性,聚合反应 在DNA聚合酶催化下，四种脱氧核糖核苷三磷酸（dATP、
5、dGTP、dCTP、dTTP）被加到DNA链的3末端，同时释放出无机焦磷酸。 1、DNA链的游离3-羟基对进入的dNTP磷原子发生亲核攻击，形成3,5-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸2、形成磷酸二酯键的能量来自-与-磷酸基之间高能键的裂解 3、聚合反应可逆，但随焦磷酸的水解可推动反应的完成 4、DNA链由5向3方向延长 5、需要有游离的3-羟基，即需要引物链,二、 DAN聚合酶结构,(一)原核生物： pol ：与校读，修复有关 A、DNA聚合酶活力：通过核苷酸聚合反应使DNA链沿53方向延长； B、 35核酸外切酶活力：由3端水解DNA链。在正常情况下该活力受抑制，一旦出现错配碱基时，聚合反应停止，
6、该活力会切去错配碱基， 起校对作用； C、53核酸外切酶活力：由5端水解DNA链。切除嘧啶二聚体和RNA引物。 小片段 ：5 3核酸 外切酶活性 大片段（Klenow片段）：聚合活性、3 5外切活性（常用的工具酶）,pol ：以带有缺口的双链DNA为模板和引物，从53方向合成DNA，同时具有35外切酶活力。可能在DNA的修复中起作用。,pol ：真正起复制作用的酶。由10种亚基组成的不对称二聚体，、组成核心酶活性：聚合活性、3 5外切活性+ pol（核心酶） pol（核心酶）+ polpol+ pol*（全酶）具有聚合酶活力，具有校对功能，是组建核心酶因子，是二聚化因子，和是延长因子，识别引物
7、并引导聚合酶结合，复制起始时被释放。pol只作用于有缺口的双链DNA，pol可作用于有引物的长单链DNA，pol*是天然的聚合酶,（二）真核生物（DNA-pol）： DNA聚合酶：与随从链的合成有关。需要以缺口双链或带引物的单链DNA为模板，引物是DNA或RNA短链，RNA引物由引物合成酶合成 DNA聚合酶：核酸外切酶活性，与修复有关 DNA聚合酶：存在于线粒体。以RNA为模板，以DNA短链为引物 DNA聚合酶：与领头链的合成有关。具有35外切酶活力 DNA聚合酶：与校读、修复和填补缺口有关,核酸外切酶活性和即时校读 DNA-pol，的3 5外切酶活性 （主要应用在引物切除后的缺口复制） 复制
8、的保真性和碱基选择 pol 的亚基 先形成氢键，再生成磷酸二酯键 依赖三种机理 1 遵守严格的碱基互补配对规律 2 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能 3 复制中出错时有即时校读功能,（三）DNA聚合酶的核酸外切酶活性和复制的保真性,三、复制中解链和DNA分子的拓扑学变化,（一）解链酶领头链 rep蛋白 Dna B随从链 解链酶,SSB：单链结合蛋白,（二）DNA拓扑异构酶既能水解，又能连接磷酸二酯键拓扑酶：切断DNA双链中的一股（原核生物中只能消除负超螺旋，真核生物中能消除正、负超螺旋）拓扑酶：切断DNA双链（同上） （三）单链DNA结合蛋白（SSB）维持模板处于单链状态保护单链的完整,四、
9、引物酶和引发体引物酶：RNA聚合酶 - Dna G引发体：Dna A辨认复制启始点，然后Dna B在Dna C帮助下结合解链区，并在DNA拓扑异构酶协助下沿DNA链5 3方向解链，并由SSB蛋白保护单链。在复制起点解链后Dna G合成RNA引物。,五、 DNA连接酶（ligase）,催化两段DNA之间的连接,NAD: 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NMN: 烟酰胺单核苷酸,+AMP,但实际上在切口处5端的往往是RNA引物切除后留下一个单磷酸基，不具备羟基亲和攻击的条件，由此：,DNA连接酶催化双链DNA切口处的5-磷酸基和3-羟基生成磷酸二酯键： （1）形成酶-AMP复合物：NAD（细菌） 连接酶-A
10、MP+NMN+连接酶 ATP（动物） 连接酶-AMP+PPi（2）形成A-P-P-DNA：连接酶-AMP+ 5P-DNAA-P-P-DNA+连接酶形成了焦磷酸键（3）生成3,5-磷酸二酯键：DNA-OH3+A-P-P-DNADNA-O-P-DNA+AMP相邻链3-OH对活化的磷原子发生亲核攻击,第三节 DNA生物合成过程,一 复制的起始（一）DNA解成单链 原核生物从一个固定的起始点开始，同时向两个方向进行的，称为双向复制 复制,真核细胞染色体比较复杂，可能有多个复制起点，同时形成多个复制单位 复制叉-复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构，称为复制
11、叉 E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包含有三组串联重复序列和两对反向重复序列,1、复制的起点： 单个固定的起点：原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，具有单个固定的起点； 多个起点：真核生物染色体是线性双链分子，含有许多起点多复制子）。,2、复制方向： 直线双向式：单起点，双方向。有对称的和不对称； 多起点双向式：真核生物染色体DNA的复制； 型双、单向式：环状DNA的复制。有双向和单向（单向的形成一个复制叉，双向的形成两个复制叉），有对称和不对称（一个叉完成1/5，其余4/5由另一个叉完成）； D-环式：单向复制。在固定点解开后一条链先复制，待复制到
12、一定距离时，露出另一链的复制起点，才开始另一链的复制；,滚动环式：单向复制，低等生物如质粒共价闭环双链分子的正链由核酸内切酶在一特定位点切开，游离出的5-磷酸基末端固定在细胞膜上，然后以环状负链为模板，从正链的3-OH末端延长形成正链。不需要另外合成引物。,（二）引发体的生成 复制过程需要引物-短链RNA 引物酶：合成RNA引物（十个bp左右），方向为5 到 3 Dna A辨认复制启始点，然后引物酶进入（DnaG蛋白） ，加上解螺旋酶、 DnaB蛋白和DnaC蛋白等，与DNA的起始复制区域形成引发体。 DNA聚合酶 由其亚单位辨认引物，新链的第一个脱氧核苷酸与引物的3-OH形成磷酸二酯键，开始
13、复制 拓扑异构酶 松弛螺旋。,复制过程中各酶和蛋白质因子的作用,二 复制的延长 原核生物为pol 真核生物为DNA 聚合酶和，其中与随从链的合成有关，与领头链的合成有关 （一）复制延长的生化过程 原核生物复制延长的速度很快 真核生物复制有多个复制起点 （二）复制的半不连续性和冈崎片段 领头链是连续合成的，而随从链则是不连续合成 冈崎片段：冈崎用电子显微镜看到了DNA复制过程中出现一些不连续片段，这些不连续片段只存在于NA复制叉上其中的一股。后来就把这些不连续的片段称为冈崎片段,三 复制的终止,（一）原核生物复制终止及不连续片段连接 复制有终止点ter 领头链是不间断延长的，随从链是 生成一个个的冈崎片段，最后连接成一条完整的DNA链。 pol 5 3外切酶活性水解引物 pol聚合活性填补空隙 DNA连接酶连接缺口。,pol,(二)真核生物的端粒和端粒酶 端粒：是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构 富含GC的重复序列 人：(TTAGGG)n 端粒酶：RNA-蛋白质复合物 既有模板，又有逆转录酶 以自身的RNA为模板延长DNA单链，然后反折为双链, 爬行模式 端粒酶与生物体的衰老、肿瘤的发生有关,
