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1、分子诊断技术平台的进展及展望,内 容 病原体检测技术概述 病原体核酸检测技术概述 病原体核酸检测新技术应用 核酸检测新技术存在问题及发展,背 景,治 疗,近10年新发传染病绝大多数是病毒引起,病毒与亚病毒 6819种 408属,动物病毒 1917种 204属,感染人 296种 37属,背景,背景,检测技术概述 形态学（电镜） 组织学（细胞培养） 免疫学（ELISA,Western Blot, IF,NT,HI） 分子生物学（PCR,RT-PCR,qPCR,mPCR, Microarray,Sequencing）,传统检测方法的局限性 胶体金 （灵敏度 窗口期） ELISA （灵敏度 窗口期）
2、PCR/RT-PCR （通量 未知病原） Real-time PCR （通量 未知病原) 巣式PCR/RT-PCR (污染，电泳）,核酸扩增检测技术概述,核酸扩增技术是一种常规生物技术，是分子生物学的基础研究方法。作为主流检测技术被广泛应用于实验室、医院。 核酸扩增技术可分为变温扩增技术和等温扩增技术。,变 温 扩 增,PCR Realtime PCR RT PCR Nested PCR Multiplex PCR Digital PCR,等 温 扩 增,TMA/NASBA SMART HDA SDA/NDA RCA/MDA LAMP/IMSA RPA,基于T7 Promoter 基于解旋酶
3、基于链置换活性的DNA 聚合酶 链置换和重组酶,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测）,核酸检测技术发展趋势 未知病原 多病原 高通量 自动化 现场技术 (POCT),中 心 实 验 室 科 研 方 向 简 介,未知病原检测技术平台,高通量自动化工作站技术平台,多病原、症候群检测技术平台,现场检测技术平台,4,1,2,3,现场检测技术 - LAMP, IMSA 多病原检/监测技术 - GeXP, Qiaxcel, RPM 未知
4、病原鉴定 - NGS，VIDISCA, RPM 自动化检测- Liquid handling system 生物信息学支持- VIP软件,检测/监测/鉴定技术平台,病毒检测/监测/签定技术平台及生物信息学,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测）,LAMP技术特点 特异性强: 2对引物配对6个区域或3对引物配对8个区域 灵敏度高： 10-100 copies 设备要求低: 不需要PCR仪器，65 水浴（等温） 检测快速： 1小时
5、 操作简单： 一步法（单管） 结果判定方便：颜色（肉眼观察颜色变化和沉淀） 吸光值（半定量，650nm比色） 普通琼脂糖电泳 浊度（浊度仪，实时监测，半定量）,实时荧光定量PCR仪,2小时,水浴、热块、PCR仪、浊度仪,电泳、浊度、颜色指示剂、肉眼观察,1小时,25￥/Reaction,仪器要求,实验结果,反应时间,实验成本,Realtime PCR 与 LAMP 特点比较,Realtime PCR,LAMP,VS,实时荧光定量PCR仪,50￥/Reaction,IMSA/EV71/CA16,JCM,2014, 52（6): 1862 MERS (submitted),Gene, 2014,
6、541, 123-128,Food and enviromental virology ,2014,GEAR /HRV,submitted,内容：LAMP检测技术应用于手足口病例的现场评价 合作单位：湖南、山东、河北省CDC 标本数量：手足口500份（每省）,LAMP 技术的现场评价,LAMP 技术现场评价,LAMP 检测技术应用于手足口病例的评价 (湖南) -Advances in Infect. Dis. 2012, 4(2) 110-118,肠道病毒EV71型核酸检测结果比较,肠道病毒CoxA16型核酸检测结果比较,小结 临床标本515份 EV71符合率100% CA16符合率99.6%
7、 参照：国产RealTime PCR 检测试剂盒,IMSA (Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification),目的：建立具有自主知识产权的等温多自配体 引发扩增反应 专利进入实质审查 引物设计软件：www.imsa-,IMSA 与 LAMP 的特点比较,IMSA 与 LAMP 方法检测手足口病结果,IMSA方法在常见传染病检测中的应用,IMSA法针对EV71和CVA16 检测的最低检测线：利用概率元分析法（probit analysis）,937,1039,1749,3266,67,108,149,430,JCM,2014,
8、 52（6): 1862,IMSA 与 LAMP 方法检测手足口病临床标本结果,IMSA法针对261份手足口临床标本的检测：以商业化qRT-PCR试剂盒检测结果为标准,IMSA法对手足口临床标本的检测，其诊断灵敏度要高于LAMP法,IMSA检测H7N9方法的建立及评估,5份临床标本的实验室检测验证 与国家流感中心结果（qPCR）相一致 卫生部临检中心的H7N9检测技术考核Panel 共计10份标本，结果全部符合，无漏检及误检 2013年12月末，参与广东省新发H7N9病例检测 结果符合，显色法结果判读准确 H7N9检测试剂盒转让北京爱普益生物科技有限公司,现场无仪器化提取核酸，发展直接法 多重
9、检测 （含内参） 污染问题,存在问题,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测）,多重PCR检测技术 温度变化多重PCR (TSP) 基于DPO引物 溶解曲线 多色探针熔解曲线,BioPlex,-J. Clin. Microbiol 2012,50(2):288,手足口病相关病毒,J. Clin. Microbiol. 2012 ,50(7)：2384； BRI，2014， 648520,腹泻相关病毒,Temperature Sw
10、itch PCR (TSP),GeXP, QIAxcel,BMC Microbiology.2013, 13:58,2013 , 8(4): e62126,BRI, 2013, 327620,研究结果,引物浓度调整：嵌合引物和通用引物的比例；各嵌合引物浓度；扩增体系选择 三个退火温度调整， 三个循环数调整，,研究结果：基于QIAxcel全自动电泳仪,两组中均加入Rnasep-DNA引物作为内参；,基于Qiaxcel的多重PCR检测技术,商业化,发热呼吸道症候群多种病原核酸检测培训班 -北京 2012. 05,“常见16种呼吸道病毒检测的多重PCR试剂盒”应用于十二五传染病重大专项发热伴呼吸道症
11、候群监测项目,“常见16种呼吸道病毒检测的多重PCR试剂盒”应用于全国流感监测网络部分实验室,呼吸道病毒多重PCR快速检测试剂盒,存在问题：病毒变异 （引物优化） 病毒地区差异 （引物优化） 结果判断 阳性对照 （16质粒/RNA） 增加病原体（流感亚型） 内参更换 （假病毒） 两管并一管（11种病毒） 流感耐药 ,基于熔解曲线分析的 多重PCR检测技术,六种常见食源性细菌的检测,引物设计单引物单模板,多引物多模板及引物分组,3 沙门氏菌,3 副溶血弧菌,1 志贺氏菌,2 致泻性大肠杆菌,1 金黄色葡萄球菌,2 李斯特氏菌,1,2,2,3,3,1,十二种腹泻病原体的检测(submitted),
12、核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测）,one-step Real-Time nested RT-PCR (ORTN RT-PCR) (submitted),基于 TSP 设计的新型一步法巣式PCR 方法,实验设计： 一管四引物两退火温度,不同长度的内外引物 退火温度不同 引物浓度不同 溶解曲线分析 极高灵敏度,实验结果：熔解曲线&琼脂糖电泳,1（L1）：阴性样品。 2（L2）：阳性样品,实验结果：EV71 标准曲线图,本试验
13、方法可用作EV71样品的定量分析， CT值可达到38.40，10倍于qPCR,新型一步法巣式PCR与荧光定量探针法PCR和传统两步法巣式PCR比较 （100份临床样品）,针对12例检测结果不同样品，采取重复试验并测序的方法验证新型一步法检测结果的准确性。,Advantages of digital PCR（优点）,Not rely on external references Increased tolerance to enzyme-inhibiting substances Simultaneous template amplification Superior precision, se
14、nsitivity and reproducibility lower coefficient of variation Reduced background DNA and contaminant levels which consequently increases the signal-to-noise ratio in positive reaction partitions,核酸检测新技术,LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自动化检测 再测序芯片 PCR 阵列 二代测序（NGS） POCT（现场检测）,自
15、动化高通量检测,Beckman Biomek NX/FX型 实验室自动化工作站,主要特点：单臂或双臂，96道、384道或智能八道加样器供选，24个微孔盘工作区，多种分注功能及配件定位器可选,未知病原检测,再测序芯片（RPM） PCR 阵列（PCR array) 二代测序 （NGS）,基于GCS 3000 TG系统的基因芯片再测序技术,未知病原RPM,完成4种不同症候群（呼吸道感染，7科23属；胃肠道感染，6科13属；脑炎和神经系统感染，6科17属；病毒性出血血热相关，4科10属）的相关病毒性病原体的全部引物和探针的生物信息学分析、设计和芯片定制（650片）和储备 建立了呼吸道感染和胃肠道感染再
16、测序检测芯片技术平台,RPM-Flu3.1： FluA(35%) 12种病毒 21种细菌,RPM-IVDC1： 86种病毒亚型 22种细菌 Plos One,2013 8(9) : e75704 Frontier in Microbiology,2015 (accepted),Resequencing Pathogen Microarray 再测序芯片（RPM）,高通量自动化的脑炎症候群检测 PCR Array方法,方法建立的基础 1：样品体积扩大,RNA,cDNA,方法所需样品量32L（16个孔）,方法建立的基础 2：96孔板的分配,特点： 1.引物组在96孔板上的分布是模式化的。 2.更快的分配体系。 3.节省了样品编号的时间。,引物组可以安排在同一个整行或整列,
