细菌分类技术课件

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1、,四 常用的研究技术,多相分类（Polyphasic taxonomy)：最初是由Colwell（1970）提出，指将微生物的各种信息和数据（包括表型、遗传型以及系统发育信息）综合起来进行比较，相互验证，互为补充，从而较为客观合理地确定微生物的分类地位，全面地反映微生物多样性特征,现代的原核生物分类是以系统发育为基础的多相分类体系,1.表型分群方法 1.1数值分类 1.2 全细胞蛋白电泳 1.3 多位点酶电泳 1.4 脂肪酸分析,2. 遗传型分群方法 2.1 基因组水平指纹图谱分析 2.2 特殊基因片断酶切图谱分析 2.3 保守基因序列分析与系统发育 2.4 基因组DNA同源性分析,分类方法包

2、括：,1. 表型分群方法,形态学特征1 个体形态:形状、大小、排列2 群体特征（培养特征）：菌落、斜面生长形态、明胶穿刺、液体培养特征 生理生化特征: 能量代谢、氧的需求、营养、 代谢产物、酶反应 生态学特征: 温度、pH、NaCl、寄生、共生、抗生素抗性等,1.1数值分类：Sneath 1957年引入细菌分类学，细菌分类学的基本方法,定义：用统计学方法根据大量表型性状将有机体分群。 进一步描述性定义：数值分类是对大量生物 个体进行大量性状观察的基础上，对研究数据进行收集处理，计算出所有供试个体之间的相似性，进而在这些相似性的基础上将全部供试个体排列成群。,原理：“等权原则”,表观群：建立在表

3、观相似性基础上的类群。 一般指数值分类得到的类群,工作步骤：,菌株选择,性状选择,进行实验,结果数据化编码,录入计算机,计算相似性,系统聚类,输出聚类结果,分析聚类结果,菌株选择：,供试菌株 参比菌株,唯一碳源利用：45种 唯一氮源利用：13种 对抗生素的抗性测定：7种抗生素四个水平 对染料及化学药物的抗性测定：10种 耐盐性测定（编码特征97-101）：5个水平 耐酸碱测定（编码特征102-107）：6个水平 生长温度范围测定：4个温度 过氧化氢酶试验（编码特征112） 脲酶测定（编码特征113） L-苯丙氨酸脱氨酶测定（编码特征114）,根瘤菌性状选择：,氧化酶测定（编码特征115） BT

4、B 产酸产碱反应（编码特征116-117） 3-酮基乳糖测定（编码特征118） 石蕊牛奶反应（编码特征119-123） 亚甲蓝还原反应（编码特征124） 耐尔蓝还原反应（编码特征125） 硝酸盐还原反应（编码特征126） 肉汤生长试验（编码特征127）,根瘤菌性状选择：,MINTS 软件进行聚类分析,优点：重复性好，易操作，能提供表型描述特征，80左右相似性水平上划分种群多样性缺点：工作量大，人为影响大，各实验室结果无法比较,1.2 SDS-PAGE全细胞蛋白电泳,原理： 蛋白质是基因的表达产物，不同的细菌蛋白质组成存在差异，蛋白质电泳图谱差异反映基因组成的不同蛋白质与SDS结合后变成线性分子

5、，其分子量与SDS结合量成正比，电泳速率与分子量大小成正比,不连续电泳缓冲系统,电泳缓冲液（Tris-甘氨酸），pH8.3,浓缩胶， pH6.8,分离胶，pH8.8,3种组分中均含有0.1%的SDS,试剂：,SDS 500 mg 巯基乙醇 1 ml 甘油 3 ml 溴酚兰 4 mg 1M pH 6.8 Tris HCl 2 ml 蒸馏水定容至 10 ml,1. 2样品缓冲液,2.Tris-甘氨酸缓冲液,This碱 25 mmol 甘氨酸 250mmol SDS 0.1% pH 8.3,步骤：,菌体培养,离心洗涤菌体,样品制备,制胶,电泳,染色,数据处理,样品制备：煮沸法（或剪切法），即将收集的

6、菌体与2样品缓冲液1：1混合，根据收集菌体的重量配成40.0 mg/ml的浓度，沸水浴变性10 min，然后置于-20保存备用。制备好的样品进行电泳后根据电泳条带的深浅做适当稀释，并调整上样量。变性后的样品可保存于-20反复使用，但每次使用前需沸水浴变性5 min，使用次数不能太多（最好不超过3次），蛋白量的减少会影响电泳图谱的清晰度。,SDS-PAGE凝胶配比,制胶,电泳：,浓缩胶：80V电泳至浓缩胶与分离胶的界面分离胶：300V电泳至前沿出去后再电泳30分钟,部分根瘤菌菌株的全细胞蛋白电泳图,采用GelCompar等软件对电泳图谱进行分析,特点：,种和种以下水平的初步分群 定性分析，不能提

7、供菌群的鉴别特征 快速简便，重复性好，与数值分类、DNA-DNA杂交具有较好的一致性 培养条件和电泳条件需要标准化，以建立菌株的全细胞蛋白电泳图谱数据库,1.3 多位点酶电泳（Multilocus Enzyme Electrophoresis, MLEE),原理： 起初应用于真核生物，基于细菌也能产生多种水溶性酶类，该技术便在细菌多样性和分类中得到应用。 通过电泳将细胞内的同功酶分离，然后用各酶的特异性底物显色，比较各种酶的迁移速率，迁移速率的不同是编码酶的基因存在多态性的一种指示。,多位点酶电泳法常涉及到的水溶性酶类有：氧化还原酶类（如酒精脱氢酶ADH等） 转移酶类（如谷草转氨酶GOT等）

8、水解酶类（如-半乳糖苷酶BGA) 裂解酶类（如顺乌头酸酶ACO) 异构酶类（如甘露糖磷酸异构酶MPI),各种酶的染色底物和方法均不同,步骤：,1. 菌体培养与收集,供试菌株经活化后在液体培养基培养至对数生长后期，离心收集菌体，用Tris-HCl(10 mmol, pH7.0）洗涤3次后备用,用等体积的Tris-HCl (10 mmol, pH7.0）悬浮菌体，加入溶菌酶（70ug/ml）后在37条件下保温40-60min，用超声波破碎或反复冻溶,2.粗酶液的制备,制胶、上样、电泳：淀粉胶，水平电泳,电极,缓冲液,纱布,淀粉胶,滤纸,4. 染色,切胶,染色,特点：,种和种以下水平的初步分群 快速

9、简便、与DNA-DNA杂交的结果高度一致 可揭示细菌群体遗传结构（遗传分化和变异）及遗传结构改变的因素：迁移与重组 同一蛋白位点可能代表了不同的蛋白 序列，无法完全揭示细菌群体遗传多样性,1.3 脂肪酸分析（fatty acid profile),收集菌体 脂肪酸提取 气相色谱分析 报告,美国MIDI公司Sherlock全自动细菌鉴定系统,表1-6 不同表型分群方法比较,2. 遗传分群方法,2.1 基因组水平指纹图谱分析 2.2 特殊基因片断酶切图谱分析 2.3 保守基因序列分析与系统发育 2.4 基因组DNA同源性分析,2.1 基因组水平指纹图谱分析,2.1.1 脉冲场凝胶电泳（Pulsed

10、-field gel electrophoresis, PFGE),原理： 寡位点限制性内切酶消化细菌总染色体，采用分辨率非常高的脉冲场电泳进行分离，得到较为简单的DNA指纹图谱,评价：,1.主要用于细菌基因组重组的研究及细菌基因组大小的评估。对根瘤菌种及种以下进行区分 2. 临床诊断中最佳的区分不同生物型的方法，在细菌分类中少用，耗时长,2.1.2 随机引物PCR扩增基础上的DNA指纹分析,1 原理： 随机引物或任意引物的寡核苷酸序列在不同细菌染色体DNA上的分布（数目和位置）不同，因此经随机引物或任意引物扩增后得到的DNA指纹图谱也不同。 方 法：根据引物碱基长度的不同，分为AP-PCR、

11、RAPD、DAF,3 应 用：主要用于研究菌株水平的多样性 局限性：1）对反应条件非常敏感2）并非所有的引物都产生足够的多态性3）适合于菌株鉴别的RAPD标记，并不一定适合于菌株聚群 4）相同的引物在不同的细菌种中鉴别能力不同,TP-RAPD(Two-Primer),2001 年由Ral Rivas等人提出,原理： 在RAPD基础上发展成的双引物随机扩增片段多态性，一般用16S rDNA的8F和1491引物，降低退火温度（50 ）进行扩增，分析其多态性,引物： 8F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3, Escherichia coli positions 8-27) 1491

12、R (5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3, Escherichia coli positions 15091491）,反应体系：Reaction bufeer 1 MgCl 1.5mM dNTP 200uM Taq E 2U Primer 8F 2um Primer 1491 2uM 水 补至25ul,扩增程序：95 9min 95 1min 50 1min 72 2min 72 6min,35,From the results obtained in this work it may thus be con-cluded that: (i)The PCR-patterns obt

13、ained with the 8F and 1491F primers are not dependent on plasmid content, ii) These patterns are not dependent on the growth phase, iii)Strains of the same species display the same patterns, iv) bacterial species from the same or different genera have different patterns.,Therefore, TP-RAPD patterns

14、are a new fingerprint of bacterial species that offers a broad range of potential applications such as clarification of the taxonomic position of some strains, taxonomic studies with a large number of isolates, and rapid identification of bacterial species. We propose the name of TP-RAPD fin-gerprin

15、ting species because two primers are used to obtain the patterns.,2.1.3 AFLP指纹分析技术(Amplified Fragment Length Polymorphism ),1 原 理,与RFLP原理基本相似，只是增加了对DNA限制性酶切片段的选择性扩增。此项技术设计了针对限制内切酶的专用连接头，以及可与连接头和酶切位点序列互补配对的专用引物，引物3端延伸出几个选择性碱基，达到选择性扩增的目的。,1）DNA提取 新鲜根瘤菌培养物适量 800ul GUTC buffer 60-70ul硅藻土悬浮液(等体积TE悬浮) 室温放置30min 13000rpm, 瞬时离心, 去上清 500ul GUTC悬浮, 室温放15min,2 方 法, 13000rpm, 离心2-3min, 去上清 600ul 洗涤buffer, 离心洗涤两次 600ul 75%乙醇离心洗涤1次 真空干燥沉淀物 50ul TE buffer悬浮, 55-65C 5-7min 离心收集上清液,