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1、专题2 微生物的培养与应用,课题1 微生物的实验室培养,.微生物,个体微小、结构简单,2.微生物的共同特点：,一.微生物基础知识,1、微生物的概念,自然界中的许多肉眼看不到的，形体微小，结构简单，通常要用显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物，统称微生物,（二）.微生物的类群,微生物,原核类:,真核类,非细胞类：,细菌、蓝藻、放线菌、支原体、衣原体,个体微小、结构简单,酵母菌、霉菌、食用菌,真菌：,原生生物：,显微藻类、原生生物（如：衣藻、草履虫、变形虫等）,病毒、类病毒、朊病毒,微生物的共同特点：,1.细菌的形态,球菌,弧菌,杆菌,螺旋菌,二分裂,2.细菌的繁殖,3.细菌的菌落,.定义：,单个或
2、者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。,.特征：,大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。,.功能：,每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。,为抵抗不良环境可形成细菌的休眠体芽孢,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候， 芽孢又可以萌发，形成一个细菌,孢子,细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的生殖
3、细胞。能直接发育成新个体。,4几种菌落及其形态,4几种菌落及其形态,微生物需要的五大类营养要素物质是：,.微生物需要的营养物质及功能,1.碳源 2.氮源 3.生长因子 4.无机盐 5.水,：凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。,无机碳源：CO2；NaHCO3等,有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等,.概念,.来源：,1. 碳源,.作用：,主要用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物。 异养微生物的主要能源物质。,不同微生物所利用的碳源不同,异养型微生物的碳源为：含碳有机物 自养型微生物的碳源为：含碳无机物,无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。,有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨
4、基酸等,凡是能够为微生物提供N元素的营养物质。,主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。,2. 氮源,.概念：,.来源：,.作用：,注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的：碳源、氮源、能源。,3.生长因子,.概念：,微生物自身不能合成或合成量不足，但又是为微生物生长和代谢所需的，因此这类物质通常称为生长因子。,（2）常见的生长因子：,维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。,pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性 特殊营养物质-生长因子如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素 氧气的含量如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件,p15,几种选择培养基,加入青霉素的培养基,分离酵母菌、霉菌
5、等真菌,不加氮源的无氮培养基,分离固氮菌,不加含碳有机物的无碳培养基,分离自养型微生物,back,加入高浓度食盐的培养基,分离金黄色葡萄球菌,.培养基,1.概念：培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的营养基质。,2.培养基的成分：,一般都含有水、碳源、氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气等的要求。,P14,P15,牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。,3. 配制原则,目的明确：,营养全面、浓度适宜、比例恰当,适宜的pH值：,有机碳源,异养型：,根据微生物的种类、培养目的选择原料,自养型：,不加碳源,加入
6、缓冲剂,细菌偏碱，真菌偏酸,（CO2碳源）,培养基的种类,不加凝固剂,加凝固剂，如琼脂,工业生产,观察微生物的运动、分类鉴定,微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种,含化学成分不明确 的天然物质,工业生产,培养基成分明确,分类、鉴定,在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长,培养、分离出特定微生物,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,鉴别不同种类微生物,选择培养基,液体培养基,半固体培养基,固体培养基,P84,按照物理性质划分培养基,固体培养基,半固体培养基,液体培养基,主要用于微生物的分离、鉴定菌落等,主要用于观察微生物的运动等
7、,主要用于工业生产,需加入凝固剂，如琼脂,2、培养基分类：,液体培养基,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,back,半固体培养基：,(是否运动),无动力,有动力(弥散),固体培养基：菌落,【典例解析】,例:关于微生物营养物质的叙述中，正确的是( )A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源
8、，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,D,思考： 1. 获得纯净培养物的关键？2. 无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？（P15旁栏思考）3. 消毒和灭菌有何不同？4. 常用的消毒和灭菌方法有哪些？,无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,.无菌技术,防止外来杂菌的入侵,消毒与灭菌的比较,煮沸消毒法：100煮沸5-6min。 巴氏消毒
9、法：70-75下煮30min或 80下煮15min。 化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源。 紫外线消毒。,.消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,表面灭菌和空气灭菌等使用 紫外线 灭菌法，所用器械是 紫外灯 。照射30min，可先喷洒石炭酸或煤酚皂溶液加强消毒效果。,（2）灭菌,a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌,灼烧灭菌,微生物的接种工具 (接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧,注意适用范围,干热灭菌 160170 ；12h,能耐高温的需要保持干燥的物品( 玻璃器皿),高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min,通常
10、用于培养基的灭菌,耐高温需保持干燥的 物品，160170 12小时,接种环、接种针等 金属用具,7075、30min 80、15min,100、56min,较为温和理化方法，,杀死部分有害菌体,（不包括芽孢、孢子）,强烈的理化方法，,杀死所有微生物,（包括芽孢、孢子）,煮沸消毒法,巴氏消毒法,化学药剂,紫外线,灼烧灭菌,干热灭菌,酒精、氯气、石炭酸等,高压蒸汽灭菌,培养基， 100KPa、 121、1530min,二.无菌技术：,防止外来杂菌的污染,1.消毒与灭菌：,请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 培养细菌用的培养基与培养皿 玻棒、试管、烧瓶和吸管 实验
11、操作者的双手,答：（1）、（2）需要灭菌； （3）需要消毒。,P16旁栏思考,超净工作台,第2课时,微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌 2、培养基的配制 3、培养基的灭菌 4、倒平板 5、微生物接种 6、恒温箱中培养 7、菌种的保存,三、实验操作,（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,操作步骤,1计算 2. 称量 3溶化 4. 灭菌 5. 倒平板,6.无菌检查：将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,p17,倒平板操作,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过
12、火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,问题讨论,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,p17,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,（二）纯化大肠杆菌,微生物接种方法常见
13、的有平板划线法和稀释涂布平板法。,1.平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线
14、之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,p18,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌
15、落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。,系列稀释操作,101,102,103,104,105,106,(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。,(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。,(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管。,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围
16、等等。,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,稀释涂布平板法：,a.梯度稀释菌液：,b.涂布平板：,不超过0.1ml,各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照,滴,灼,试,涂,3平板划线法和稀释涂布平板法的比较,1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。,四、结果分析与评价,3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。,
