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1、特殊毒性试验及其评价,第一节 致突变作用及其试验方法与评价 第二节 生殖发育毒性作用及其试验与评价 第三节 致癌作用及其试验方法与评价,第一节 致突变作用及其试验与评价方法,一、 基本概念 二、突变类型 三、突变的发生与修复机制 四、致突变试验与致突变作用评价,1DNA与基因 DNA由脱氧核糖、磷酸及碱基组成，基本成分为四种核苷酸，形成双螺旋结构。,遗传学基础,基因（gene）：DNA分子中最小的完整功能单位，是生物遗传信息的携带者 基因组（genome）：细胞或生物体的一套完整单体的遗传物质,2、染色质与染色体 在间期细胞的细胞核中，通过光镜可见一种能被碱性染料着色的物质，即染色质。 它由D
2、NA、组蛋白、非组蛋白及少量的RNA组成，形似串珠状的复合体。,在间期细胞核中，一般没有染色体结构，只有在细胞分裂时，染色质才螺旋化并折叠成染色体，故染色质与染色体是由相同物质组成的； 染色体存在于细胞中，通常只有在细胞分裂时经过特殊染色才能清楚地看到。,2009-6-30,染色体与基因有着平行的关系,染色体可以在显微镜下看到。 染色体成对存在，基因也成对存在。 个体中成对的基因一个来自母本，另一个来自父本。 不同对基因形成配子时的分离与不同对染色体在减数分裂期的分离，都是独立分配的。,3、基因型与表型 基因型指控制生物性状的基因组成，它是生物体的遗传组成。基因型是性状发育的内因，是表型形成的
3、根据。表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表现。外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。,细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂终了所经历的过程。,G0 ：DNA合成前期；G1 ：DNA合成期；S：完成DNA复制；G2：为有丝分裂做准备；M：有丝分裂期,4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂,有丝分裂过程,有丝分裂指细胞核分裂的过程，一个细胞由此生成两个子细胞，每个子细胞各具有与亲代细胞完全相同的染色体。,减数分裂过程,生物物种可以通过各种繁殖方式来保证世代间生命的延续，这个过程称为遗传。 遗传的稳定是相对的。 在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异，这种差异称为变异。
4、,一、基本概念,造成生物变异的原因有： 亲代个体杂交产生子体，由于重组而发生； 由于基因突变而发生，它是新基因产生的根本来源； 由于生物的染色体组成或细胞质发生变化而产生。,自发突变 (spontaneous mutation)是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。特点：自发突变的发生过程长，频率极低 , 与物种的进化有关。 诱发突变 (induced mutation)是指人为的造成突变 。它已被农、林、牧、渔业和园艺学家利用来培育和选择新种或良种。特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害。,遗传物质发生变化引起遗传信息的改变，并发生新的表型效应称为突
5、变。,突变的分类,基因突变 (gene mutation)：一个或几个DNA 碱基对的改变。用光学显微镜观察不到，必须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断。 染色体畸变 (chromosome aberration)：染色体的结构及数目改变，可用光学显微镜进行观察。 染色体结构改变 染色体数目改变,二、突变类型,遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤： 基因突变 染色体畸变,基因突变 一个或几个DNA碱基对的改变。,染色体畸变 染色体的结构及数目改变。,端粒,姊妹染色单体,着丝粒,组 蛋 白,双 螺 旋,碱基对,端粒,这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA以外的靶组织受损所致。 基因突变、
6、染色体畸变及染色体数目变化的本质是相同的，其区别在于受损程度。,通常以光学显微镜的分辨率0.2 m来区分基因突变和染色体畸变。 基因突变是用光学显微镜观察不到的，须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断，而染色体畸变可用光学显微镜进行观察。,1. 基因突变,基因突变指基因中DNA序列的变化。 因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变。,碱基置换指DNA序列上的某个碱基被其他碱基取代。首先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对，于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即最终产生碱基对置换或简称碱基置换。,
7、移码突变移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。,整码突变指在DNA中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子。 片断突变指基因中某些小片断核苷酸序列发生改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基因。片断突变包括缺失、重复、重组、重排。,2. 染色体畸变,指染色体的结构异常和数目异常，它是指遗传物质大的改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现。,（1）染色体结构异常有些畸变是稳定的，可通过重复细胞分裂传给子代。这些畸变如缺失、倒位、重复及平衡易位等，多数为染色体重排，可在机体或细胞群传递。,容易观察到的畸变有染色单体断裂、染色体断裂、无中心粒片段、染
8、色单体交换、双中心粒染色体、环状染色体及某些相互易位。,染色体结构变异类型,染色体缺失,如果蝇的缺刻翅,染色体重复,如果蝇的棒状眼,染色体倒位,染色体易位, 如夜来香的变异,在染色体上出现无染色质的区域，但该区域两端的染色体仍保持线状连接者为裂隙。,指染色体上狭窄的非染色带，无线状连接者为断裂。带宽超过染色单体宽度。,裂隙（gap）和断裂（break）,一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些已断裂的节段远远分开，常将无着丝粒断片简称为断片。有着丝粒的部分称为缺失，缺失有末端缺失和中间缺失。,无着丝粒断片（fragment）、缺失（deletion）,染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝
9、粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体。,环状染色体（ring chromosome）,当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180再重接，称为 倒位。,倒位（inversion）,当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入。 如果此时有缺失的染色体和插入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完全相同的节段，此时称为重复。,插入（insertion）和重复（duplication）,两个非同源染色体断裂后，从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。,易位（transloc
10、ation）,（2） 染色体数目异常整倍性畸变：单、三、四、多倍体 非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条或多多条或少多条2n-1,2n-2,2n+1,2n+2,染色体数目异常的基本类型,注：A、B、C、D代表非同源染色体,三、突变的发生与修复机制,外源化学物引起基因突变和染色体突变的靶部位主要是DNA，而导致染色体数目异常的靶部位主要是有丝分裂和减数分裂器，如纺锤丝。,致突变作用（mutagenesis）：是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。 致突变物：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂。又称为遗传
11、毒物。,四、致突变试验与致突变作用评价,观察化学毒物致突变作用一般通过致突变试验来进行。主要目的： 检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性； 检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人体的遗传危害性。,观察项目的选择,基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。 但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变过程中发生的其他事件。将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(genetic mdpoint)。,正常DNA,DNA损伤,DNA修复过程,未修复的DNA,损伤表
12、达,断裂的DNA分子,染色体结构异常,基因突变,细胞死亡,非整倍体 多倍体,重组事件 SCE 有丝分裂性交换,染色体分离异常,细胞屏障,遗传毒物,无误修复,易错修复,细胞分裂,突变发生中的事件及遗传学终点的关系,常用的致突变试验,1、细菌回复突变试验（Ames试验） 2、哺乳动物细胞基因突变试验 3、果蝇伴性隐性致死试验 4、染色体畸变分析 5、微核试验 6、姐妹染色单体交换试验,7、显性致死试验 8、小鼠可遗传易位试验 9、细菌DNA修复试验 10、程序外DNA合成实验 11、精子畸形试验 12、小鼠特异基因座试验,2009-6-30,上一内容,回主目录,返回,下一内容,返回,上一内容,下一
13、内容,回主目录,致突变试验组合的原则,一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。如细菌回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析和姐妹染色单体交换试验，这一组试验包括主要类型遗传学终点。 体内试验与体外试验配合。一般体内试验和体外试验各有其优缺点，应取长补短，综合考虑。 配套实验应包括多种进化程度不同的物种。如原核细胞、低等和高等真核细胞，这样更加具有说服力。,以营养缺陷的突变体菌株为试验系统，观察受试物引起其回复突变的作用。试验菌株：鼠伤寒沙门氏菌Ames试验大肠杆菌大肠杆菌回复试验,1、细菌回复突变试验,Ames试验原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突
14、变成野生型(his+)的能力。试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养琼脂平板上不能生长。,鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+),组氨酸营养缺陷型突变株(his-),正向突变,回复突变,代谢活化系统,受试物,有点试验和掺入试验两种。应分别进行不加及加代谢活化系统的试验，常用为S9混合液，即用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆经9000g离心得到的上清液，再加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等辅助因子。,Ames试验标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变，TA100检测碱基置换突变，TA102对醛、过氧化物和DNA交联剂较敏感。 这四个试验菌株除了含有his-突变
15、，还有一些附加突变，检测时提高试验敏感性。 Ames试验的方法有平板掺入法，点试法及预培养法等。,突变型试验菌株可被各种诱变因素诱导，回复突变成野生型(his+) ，即恢复了合成组氨酸的能力，可在此平板上生长成可见菌落。 如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的致突变物。,结果判断,只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。 仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。 不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。 加S9混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。,哺乳动物细胞基因突变试验是利用啮齿类和人
16、体外培养细胞的基因正向突变试验。,常用细胞株 选用的基因座小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y ） TK、HPRT中国仓鼠卵巢组织细胞（CHO） HPRT中国仓鼠肺组织细胞（V79） HPRT人淋巴细胞 HPRT,2. 哺乳动物细胞基因突变试验(mammalian cell gene mutation assay),TK：胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脱氧核苷ATP 胸苷酸。存在嘧啶类似物5-溴脱氧尿苷时，产生异常核苷酸使细胞死亡。受试物存在时若细胞不死亡说明TK发生突变。,（1）TK基因座,次黄嘌呤、鸟嘌呤转磷酸核糖基酶：催化次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖焦磷酸 核苷-5-单磷酸（NMP），补充途径。如存在碱基类似物，生成相应的NMP，掺入到DNA中可致死。加入受试物后能存活的细胞表示发生基因突变HPRT-。,
