《医学研究荧光定量原理与分析方法张玖强课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《医学研究荧光定量原理与分析方法张玖强课件（63页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD,荧光定量原理与分析方法,Zhang Jiuqiang,内容概要,实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的分类 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 SYBR法实验流程及注意事项,实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,与常规 PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时荧光定量PCR原理定义,扩增曲线荧光阈值Ct值,实时荧光定量PCR原理常用名词概念,C
2、ycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Logliner phase,Logliner phase,实时荧光定量PCR原理什么是扩增曲线,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Logliner phase,Logliner phase,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动 设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过域值,Threshold,实时荧光定量PCR原理什么是荧光域值,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Ct值的定义：PC
3、R扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,C(t) value,实时荧光定量PCR原理什么是Ct值,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值极具重现性,实时荧光定量PCR原理 Ct值的重现性,理想的PCR反应,XnX0 2n,*,Xn：第n次循环后扩增产物数量,X0 ：起始模板数量,n：扩增循环数,实时荧光定量PCR原理 Ct值定量的数学原理,非理想的PCR反应,XnX0 （1En）n,*,Xn：第n次循环后扩增产物数量,X0 ：起始模板数量,n：扩增循环数,实时荧光定量PCR原理 Ct值定量的数学原理,在扩增产物达到荧光阈值时,XCtX
4、0 （1En）CtM （1）,*,XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M,方程式（1）两边同取对数得：,LogMLogX0 * （1En）Ct （2）,整理方程式（2）：,LogX0 Log M CtLog（1En）,实时荧光定量PCR原理 Ct值定量的数学原理,Cycle number,Ck 104,Ck 102,Sample,Log of DNA concentration,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系,LogX0 Log M CtLog（1En）,实时荧光定量PCR原理 Ct值定量的数学原理,内容概要,
5、实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的分类 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 SYBR法实验流程及注意事项,实时荧光定量PCR的分类,不同的荧光标记方法不同的应用目的,特异性荧光标记：1.TaqMan2.Molecular Beacon 非特异性荧光标记：3.SYBR Green,实时荧光定量PCR的分类常用荧光标记方法,1、TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探
6、针,实时荧光定量PCR的分类,实时荧光定量PCR的分类TaqMan法的工作原理,每扩增一条DNA分子释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,实时荧光定量PCR的分类,1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：一般为：94 ，10-20S60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相
7、同,TaqMan 法PCR反应的建立,对目标序列的高特异性阴性结果确定设计相对简单与目标序列某一区域互补重复性比较好,优 点,只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针,缺 点,实时荧光定量PCR的分类Taqman法优缺点,标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成,2、分子信标(Molecular Beacon),实时荧光定量PCR的分类,实时荧光定量PCR的分类,分子信标工作原理,3、SYBR Green 法,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光； 变性时，DNA双链分开，无荧光,实时荧光定量PCR的分类,实时荧光定量PCR的分类SYBR
8、Green 染料,SYBR Green 结合到DNA小沟部位示意图,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),实时荧光定量PCR的分类,原始图谱,对数图谱,SYBR Green法融解曲线定义,实时荧光定量PCR的分类,SYBR Green法融解曲线分析,容易与非特异性双链DNA结 合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高,缺 点,实时荧光定量PCR的分类SYBR方法的优缺点,实时荧光定量PCR的分类几种方法的比较,实时荧光定量PCR的分类,不同的荧光标记方法不同的应用目的,定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析
9、，基因拷贝数定量， GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯片结果验证，差异显示结果验证等,实时荧光定量PCR技术的应用,内容概要,实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的分类 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 SYBR法实验流程及注意事项,Sample,绝对定量分析方法简介绝对定量定义,Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,未知样品与已知浓度的标准曲线进行比较,标准品的一些标准： 必需用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩
10、增效率相同 标准品必需是经过准确定量的（例如，用分光光度计定量） 标准品必需是标准化的（例如，同一化的细胞数） 在每组实验时，必需用相同的阈值设定来确定Ct值,绝对定量分析方法简介绝对定量的标准品,绝对定量分析方法简介标准样品的制备,拷贝数的计算 待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数 样本分子量=碱基数324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014,倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲
11、液，得标准品v,绝对定量分析方法简介,乙肝病人血液中HBV的绝对定量目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe） 目录号（FP203）设置对照：浓度为106、105 、104 、 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照实验步骤：提取HBV DNA设计特异引物设计TaqMan探针并标记探针扩增程序结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数,绝对定量分析方法简介举例1,绝对定量举例：HBV病毒检测 以Taqman探针进行,S
12、ample: HBV阳性标准品，分别含有5103、5104、5105、5106 copies /ml,实验数据：,绝对定量分析方法简介举例2,扩增效率（E）计算E=10-1/斜率=10-1/-3.17=2.03E%=(2.03-1) 100%=103%,标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线,y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988,绝对定量分析方法简介举例2,如未知样本Ct为20.5,标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线,将Ct值带入线性方程：,20.5= -3.1726 X + 37.52,X=,20.5-37.517,-3.1726,=5.36,
13、QuantityUnknown=105.36=229087 copies,y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988,绝对定量分析方法简介举例2,内容概要,实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的分类 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 SYBR法实验流程及注意事项,相对定量分析方法简介为什么要用相对定量,模板均一性问题：起始的细胞数、细胞的状态、均一性等 RNA制备：RNA纯化得率、均一性等 反转录：反转录的效率等,相对定量分析方法简介内参照,GAPDH Beta-actin beta-2-microglobulin (B2M) ribosomal protein
14、 L13a (RPL13A) PPIA (Cyclophilin) ubiquitin C (UBC) eukaryotic translation initiation factors 4A (eIF4A) 18S rRNA ,方法： 双标准曲线法2 Ct,相对定量分析方法简介几种不同的相对定量方法,对照样品目的基因浓度,待测样品参照基因浓度,优点：分析简单，实验优化简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线；必需有固定的标准品做标准曲线；这些标准品并不代表样品扩增的真实状态 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,F=,待测样品目的基因浓度,对照样品参照基因浓
15、度,公式：,相对定量分析方法简介双标准曲线法,相对定量分析方法简介Ct法：,公式： 优点：优化的体系建立后，每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可 要求：标准曲线斜率差值0.1 缺点：假定扩增效率为 100 %；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,实验数据：,Sample,处理前,处理后,Jun(MeanCt),GAPDH(MeanCt),E,18 16,17 17.4,1.95 1.95,2 - Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100，且相对偏差不超过5,Ct（处理前）18171 Ct（处理后）1617.4=1.4 Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）1.412.4 比率（处理后/处理前）=2Ct2（2.4）5.3 所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5.3倍,修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的或增效率，但扩增效率不等于2，那么2Ct可以修正为：ECt，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95Ct,
