分子育种教案

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1、植物分子育种教案沈法富i目 录 第一编 植物分子标记辅助育种（20 学时） 第一章遗传标记概述（3 学时） 第一节 遗传标记的发展 第二节 遗传标记的种类 （一） 形态标记 （二） 细胞学标记 （三） 蛋白质标记 （四） DNA 标记 第二章 DNA 标记技术（3 学时）第一节 DNA 杂交的分子标记 （一） RFLP 技术 （二） VNTR 技术 第二节 PCR 技术的分子标记 （一） 随机引物的 PCR 标记 （二） 特异引物的 PCR 标记 第三节 限制性酶切和 PCR 的分子标记 （一） AFLP 标记 （二） CAPS 标记 第四节 单核苷酸多态性的 DNA 标记 第三章 分子图谱的

2、构建（4 学时）第一节 作图群体的建立第二节 图谱构建的理论基础第三节 DNA 标记分离数据的数学处理 第四节 DNA 标记图谱的完善 第五节 比较作图 第四章 质量性状的分子标记（3 学时）第一节 近等基因系分析法第二节 分离体分组混合分析法 第五章 数量性状的分子标记（3 学时）第一节 数量性状基因的初级定位 第二节 数量性状基因的精细定位 第六章 分子标记辅助选择技术（4 学时） 第一节 质量性状的标记辅助选择技术 第二节 数量性状的标记辅助选择技术 第三节 标记辅助选择技术的应用研究 第四节 分子标记辅助选择的发展策略 第一编 转基因植物育种（20 学时） 第一章 转基因育种的基础（4

3、 学时） 第一节 目的基因的克隆与表达载体的构建 第二节 植物遗传转化技术 第三节 转基因植物的筛选与鉴定 第四节 转基因植物的遗传规律 第二章 转基因植物与优质育种（3 学时） 第一节 改变植物贮藏蛋白的品质 第二节 调节碳水化合物的合成 第三节 改善植物油脂的品质 第四节 改良棉花纤维品质ii第三章 转基因抗病育种（3 学时） 第一节 植物抗病基因的克隆 第二节 抗植物病毒基因工程 第三节 抗真菌植物基因工程 第四章 转基因抗虫育种（3 学时） 第一节 Bt 毒蛋白基因 第二节 其他抗虫基因 第三节 植物转基因抗虫研究的进展 第五章 转基因抗非生物逆境育种（4 学时） 第一节 植物耐盐基因

4、工程 第二节 耐旱基因工程 第三节 抗除草剂基因工程 第四节 抗寒冷基因工程 第六章 转基因作物的安全性及其对策（3 学时） 第一节 转基因作物的潜在风险 第二节 转基因作物作为食品的安全性问题3第一章第一章 遗传标记概述遗传标记概述遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变 异。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。遗传标记可以帮助人们更好地研 究生物的遗传与变异规律。在遗传学研究中遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转 移等。在作物育种中通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。在现

5、代分 子育种研究中，遗传标记的应用已成为基因定位和辅助选择的主要手段。纵观遗传学的发展历史，每一种 新型遗传标记的发现，都大大推进了遗传学的发展。第一节第一节 遗传标记的发展遗传标记的发展19 世纪后半叶，孟德尔（G. Mendel）以豌豆为材料，利用七对外部形态特征差异明显、易于识别 的相对性状，对杂种后代的不同个体依性状表现进行归类分析，提出了“遗传因子”假说，并发现了生物 遗传的分离规律和独立分配规律，即著名的孟德尔定律。1910 年，摩尔根（T.H. Morgan）在哥伦比亚大 学的实验室发现一种奇特的果蝇，它的眼色不是野生型的红色而是白色，摩尔根用白眼雄蝇与野生型杂交， 发现在 F1

6、代中白眼为隐性性状，在 F2代中红眼与白眼的遗传符合孟德尔分离规律。但是在按雌雄性别分 别记数时发现了异常现象，雌蝇全部为红眼，雄蝇中一半为红眼一半为白眼。由此发现决定眼色的基因与 决定性别的基因是连锁遗传的，从而产生了著名的摩尔根遗传学说。果蝇白眼遗传标记的发现成为近代遗 传学研究的一个里程碑。1913 年，A. H. Sturtevant 通过连锁遗传分析成功地在果蝇的 X 染色体上定位了 5 个基因，从此确定了遗传学的染色体理论和遗传作图的基本原理。 1910 年以后，摩尔根将孟德尔“遗传因子”的行为与染色体的行为结合起来进行研究，证实了“遗传 因子”是染色体上占有一定位置的实体，由此导

7、致了细胞遗传学的诞生。通过对不同物种染色体形态、数 目和结构的研究，发现各种非整倍体、染色体结构变异以及各种异形染色体等都有其特定的细胞学特征， 可以作为一种遗传标记来测定基因所在的染色体及其相对位置，或通过染色体代换等遗传操作进行基因定 位。这种能明确显示遗传多态性的细胞学特征，通称为细胞学标记。 1941 年，美国遗传学家 G. W. Beadle 和生化学家 E. L. Tatum 通过研究红色面包霉的生化突变型，对 一系列营养缺陷型进行遗传分析，提出了“一个基因一个酶”的假说，创立了生化遗传学。50 年代许多科 学家发现同一种酶可具有多种不同的形式。同时由于淀粉凝胶电泳技术的发展和组织

8、化学染色剂的使用， 使这种酶的多种形式成为肉眼可辩的带型酶谱。1959 年，C. L. Markert 和 F. Moller 根据对几种动物乳 糖脱氢酶的多种形式的研究，提出了用同工酶（isozyme）一词来描述具有同一底物专一性的不同分子形式 的酶，并证实了同工酶具有组织、发育及物种的特异性。通过同工酶的电泳谱带可以清楚地识别同工酶的 基因型，因此可以作为一种遗传标记加以利用，并且可以将编码酶的基因通过遗传分析定位在染色体上。 同工酶标记是建立在生化遗传学基础上的，所以又称为生化标记或蛋白质标记。蛋白质标记是一种分子标 记，但仍是以基因表达的结果（表现型）为基础的，是对基因的间接反映。 1

9、953 年，J. D. Watson 和 F. H. C. Crick 提出了 DNA 分子结构的双螺旋模型，圆满地解释了 DNA 就是 基因的有机化学实体，宣布了分子遗传学时代的到来。现代基因概念的发展使直接利用 DNA 分子中核苷 酸序列的变异作为遗传标记成为可能。1980 年，人类遗传学家 D.R.L. Botstein 等首先提出了 DNA 限制性 片段长度多态性（RFLP）可以作为遗传标记的思想，开创了直接应用 DNA 多态性发展遗传标记的新阶段。 RFLP 标记的诞生大大加速了各种生物遗传图谱的建立和发展，同时也提高了基因定位的精度和速度。 1985 年，DNA 多聚酶链式反应(P

10、CR)技术的诞生，使直接体外扩增 DNA 以检测其多态性成为可能。1990 年，J.G.K. Williams 等和 J. Welsh 等两个研究小组应用 PCR 技术同时发展了一种新的 RAPD 分子标记。随 后，基于 PCR 技术的新型分子标记不断涌现，使得 DNA 标记走向商业化、实用化。 由形态标记向分子标记逐步发展的过程，体现了人类对于基因由现象到本质的认识发展过程。在这一 过程中，传统的形态标记和细胞学标记始终是遗传标记发展的基础，而蛋白质标记和 DNA 标记则是遗传 学、生物化学和分子生物学的发展导致遗传标记发展的必然结果。随着科学技术的不断进步，新型的分子 标记还将不断涌现，新

11、近发展的基于 DNA 测序和 DNA 芯片技术的 SNP 标记已为 DNA 标记技术的发展展 示了美好的前景。4第二节第二节 遗传标记的种类遗传标记的种类一、形态标记一、形态标记 形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。 典型的形态标记用肉眼即可识别和观察。广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状如 生理特性、生殖特性、抗病虫性等。由自发突变或物理化学诱变均可获得具有特定形态特征的遗传标记材 料。例如在组织培养及诱变育种过程中经常出现的大量变异材料，其中不乏在形态特征或生理特性上具有 特殊表型的个体，经过选择，就可获得稳定遗传的形态

12、标记材料。形态标记材料多数仅带有一个标记基因， 但有的则带有多个标记基因。后者用于基因连锁分析时，可同时分析几个标记性状。形态标记材料在遗传 研究和作物育种上都有重要的应用价值，因此对形态标记材料的收集、保存和利用历来受到各国研究者的 重视。在水稻中，目前已有的形态标记材料，大多是经过精心选育获得的。国际水稻所和日本系统地收集 了大量的形态标记材料，并作为重要的种质资源加以保存。在水稻中已有多达 300 多个形态标记材料。在 番茄中已发现的形态标记也有 300 多种，其中苗期无花色素标记与抗烟草花叶病毒病的 Tm-2 基因连锁， 叶状腺的大小与抗桃霉病基因连锁。在大豆中也积累了大量的形态标记材

13、料，其中部分标记基因已定位在 相应的连锁群上（表 1.1） 。 形态标记基因的染色体定位最初是通过经典的二点、三点测验进行的。通过判断不同性状间的遗传是 否符合独立分配规律，来确定控制这些性状的基因是否连锁。采用这种方法把相互连锁在一起的基因定为 一个连锁群，并与染色体相对应，以性状间重组率作为这些基因在染色体上的相对距离，并确定其毗邻关 系。1910 年，摩尔根领导的实验室根据对果蝇六个形态性状的分析，发现了连锁遗传现象，并根据研究性 状与形态标记的连锁关系，构建了生物中第一张遗传连锁图，开创了利用已知染色体相对位置的标记基因 定位未知基因的先例。1928 年，赵莲芳根据 8 个水稻品种的杂

14、交资料，研究了茎、叶和颖花等器官的颜色、 护颖长度、谷粒外形等 12 种性状的遗传，由其中 9 个基因的相互关系，确定了水稻的三个连锁群。借助 于这种方法在一些栽培物种中确定了许多质量性状基因的连锁关系及其在染色体上的相对位置，并绘制出 较为完整的遗传连锁图谱。以形态标记为基础的连锁群的建立为生理、生化性状的遗传研究奠定了基础。 由于形态标记数量少、可鉴别标记基因有限，因而难以建立饱和的遗传图谱。另外，许多形态标记还 受环境、生育期等因素的影响，使形态标记在植物育种中的应用受到一些限制。5表表 1.1大豆部分形态标记性状及标记基因（Shoemaker and Olson 1993）标记性状标记

15、基因（括号内数字表示所在连锁群） 色素 花色W1，w1（8）茸毛色T，t（1） 荚色L1，l1（5） ；L2，l2种皮G，g（3）种脐R，r-m（2） ；I，i-i，I-k，i（7） 双色K1；K2；K3子叶色D1（3） ；D2；Cyt-G，Y3 叶小叶数目L-f1，l-f2叶形ln（4） ；Lo，lo；l-w1，l-w2；l-b1,l-b2； 落叶性A叶绿素缺失V1；y3；y4； y20 茸毛类型Pa1，pa1；Pa2，pa2；P1，p1（2） ；P2，p2（4） ；Pb，pb（14） ； Pc，pc；Pd1，pd2；Ps，ps茎 扁化茎f(11)节间长度S，s 短叶柄Lps，lps矮杆df

16、2（6） ；df3；df4；df5（1）花 花序长短Se，se开花和成熟E1，e1（1） ；E2，e2；E3，e3；E4，e4；E5，e5 无限结荚习性Dt1，dt1（5）；Dt2，dt2种子种皮健全度De，de 种皮泥膜B1；B2；B3根 根部荧光fr1（12） ；fr2；fr4；Fr3根瘤菌反应rj1（11） ；Rj2；Rj3；Rj4雄性不育 染色体联会突变st2；st3；st4；st5（8）花药开裂不良Ft 花丝伸长不良fs1；fs2雄性不育突变体P2（4） ；ms1（8） ；ms2；ms3；ms4；ms5；ms6（8）抗病性 大豆灰斑病Rcs1；Rcs2大豆霜霉病Rpm 白粉病Rmd大豆疫根腐病Rps（10）大豆锈病Rpp1；Rpp2；Rpp3 细菌性斑点病Rpg1细菌性斑疹病Rxp 大豆花叶病毒病Rsv1（13） ；Rsv2大豆孢囊线虫病rhg1；rhg2；rhg3；Rhg4；二、细胞学标记二、细胞学标记 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学 标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。染色体结