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1、2018/10/7,1,沉默idl基因表达对食道 癌细胞Eca-109生物学行为的影响,小组成员：王丽、汪霖、王金华、许双双、蒋爱军、李彩红、杨欢、张小虎,J Sichun Univ （Med Sci Edi）2010；41（3）；328-385,读书报告,2018/10/7,2,研究背景 实验原理 实验材料 实验内容与步骤 实验结果 讨论,2018/10/7,3,食道癌是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率列肿瘤第六位，目前对食道癌的治疗多采用手术和放疗为主、化疗为辅的综合治疗措施。但是，由于食道癌的耐药性，5年的存活率仅为11.7，因此研究一种技能提高肿瘤效果同时毒性又低的方法具有重要意义。,研究
2、背景,2018/10/7,4,当前，基因治疗是非常有前途的研究方向，RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是基因治疗研究的热点，RNAi的特异性及高效性使其可能成为前景光明的治疗方案。 分化抑制因子(Id)蛋白是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的核转录因子的负调控蛋白，具有抑制细胞分化的作用。其中，又以Id1蛋白的研究最为广泛。,2018/10/7,5,本研究采用DNA重组技术构建针对idl的短发卡RNA(shRNA)表达载体，观察其对idl表达抑制作用，研究idl基因沉默后对Eca一109细胞生长、增殖产生的影响，探索食道癌治疗的新方法。,实验原理,2018/10/7,6,
3、实验材料,pGFU6neo载体(上海吉玛公司) LipofactamineTM 2000试剂盒(Invitrogen公司)； 各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶(TaKaRa公 司)； 总RNA提取试剂盒(BioBasic公司)； RT-PCR 试剂盒(TaKaRa公司)； Idl、p16、增殖细胞核抗原 (PCNA)和-actin抗体(Santa Cruz公司)； 羊抗兔 二抗(北京中杉产品)。 食道癌细胞株Eca-109由教研室保存提供。,2018/10/7,7,实验步骤, shRNA序列设计与重组质粒的构建 食道癌细胞Eca一1O9的分组及转染 RT-pCR检测idl tuRNA含量
4、细胞生长曲线测定 克隆形成检测细胞增殖 流式细胞术检测细胞增殖和周期分布 Western blot检测Idl、pl6、PCNA蛋白 表达8.统计学方法,2018/10/7,8,shRNA序列设计与重组质粒的构建,根据 GenBank中报道的idl的cDNA序列 ，参考Ambion公司小分子干扰RNA (siRNA)设计原则和在线设计分析,分别设计两对可干扰序列。 模板链退火 后被克隆至pGFU6neo载体中，分别命名为 pGFU6neoidl一1、pGFU6neoidl一2和pGFU6 neoNC。其中，pGFU6neoNC为通用对照质粒。 重组质粒送吉玛公司酶切(BarnH I和Bbs I)
5、和测 序鉴定。,2018/10/7,9,食道癌细胞Eca一1O9的分组及转染,Eca一 109细胞复苏、培养增至70%汇合时，按 LipofectamineTM 2000脂质体转染说明书进行转染， 48 h后600 gmL G418进行筛选，两周后出现单 克隆，用克隆环法挑取，用400gmL浓度G418维 持。实验共分为3组：,实验组 (pGFU6neo-idl一1、pGFU6neo-idl-2),阴性对照组 (pGFU6neo- NC),未转染对照组,2018/10/7,10,RT-pCR检测idl tuRNA含量,根据idl 基因序列，设计其特异性引物：上游引物5 -CTGTTCCATTT
6、TCCGTATC TGC一3 ， 下游引物5 r_GCTCCTTGAGGCGTGA GTAA一3 ，产物大小为318 bp；内参Bactin引物：上游引物5，-GCGGGAAATCGTGCGTGA(、-3 ，下游引物5，_ATGCCCAGGAAGGAAGGCT一3 ，产物 大小为191 bp。 将各组细胞按Trizol操作说明书提取总RNA，按RTPCR试剂盒说明书检测idl mRNA含量 取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶系统成像。密度扫描半定量分析，根据相应 条带灰度值计算抑制率。,2018/10/7,11,细胞生长曲线测定,实验组 阴性对照组 未转染对照组,1105个细胞各接种60
7、 cm2 培养瓶中,实验组,阴性对照组,未转染对照组,48h,48h,48h,胰酶消化+0.4%台盼蓝染色,光镜下记录 活细胞数,连续观察6天，绘制细胞生长曲线,2018/10/7,12,克隆形成检测细胞增殖,分别接种500个 实验组和对照组细胞于每一平皿(60 ram)中，培养 1O14 d后，经40 gL多聚甲醛固定，2 Giemsa 染色，低倍镜下计数100个细胞的克隆。,2018/10/7,13,流式细胞术检测细胞增殖和周期分布,实验组,阴性对照组,未转染对照组,PBS洗涤 +70冰乙醇固定 +500g/ml碘化丙啶+10mg/mlRNA酶A,各取食道癌细胞1*106个,37避光染色3
8、0min,37避光染色30min,37避光染色30min,对照组,阴性对照组,未转染对照组,流式细胞仪检测 所处的细胞周期,分别计算G0/G1期、 S期细胞所占的百分比,每组 重复 试验 3次,2018/10/7,14,Western blot检测Idl、pl6、PCNA蛋白表达,分别收集实验组和对照组细胞，提取细胞总蛋 白，BCA法定量。,50g,SDS-PAGE,50V,NC膜,加入1；500 稀释的一抗,孵育过夜,TBST洗膜,加入1；2000 稀释的二抗,37孵育1h,化学发光法 （ECL）显色,运用BioRad公司的Quantity one软件对Western blot结果进行图像分
9、析。以Bactin为内参，比较免 疫印迹相应蛋白条带的光密度值。,2018/10/7,15,统计学方法,数据用S表示采用单因 素方差分析和t检验，P0.05为差异具有统计学意义。,2018/10/7,16,实验结果,1.重组质粒的酶切鉴定及序列测定3组质粒pGFU6neoidl一1、pGFU6neoidl一 2、pOFU6neoNC经测序，结果显示与设计DNA 片段完全一致，符合设计要求。,2018/10/7,17,2.RT-PCR分析idl mRNA的表达结果显示；pGFU6neo-idl-1电泳带较 pGFU6neo-NC及未转染组明显减弱，而pGFU6 neoidl一2变化不明显(图1)
10、。表明；只有pGFU6 neoidl一1重组质粒可以抑制idl基因表达，其抑制效率达(824)%(P005)。,2018/10/7,18,3.Western blot分析内源性Idl蛋白表达 结果显示；pGFU6neoidl一1与其余3组相比，食道癌细胞内Idl蛋白的表达明显下降（图2），其抑制率为（455）%（p0.05）。表明；重组载体pGFU6 neoidl一1可以有效沉默Idl蛋白表达。,2018/10/7,19,4.细胞增殖和周期分析细胞增殖分析台盼蓝排除试验测定，转染了pGFU6 neoidl一1质粒的Eca-109 细胞增殖能力明显低于转染对照质粒的细胞pGFU6neo-NC（图
11、3）。同时，idl基因被沉默后，食道癌细胞的克隆形成（(293)%）低于阴性对照组细胞（566）%，p0.05）。,2018/10/7,20,细胞周期分析流式细胞仪分析结果显示(图4)，pGFU6neo-idl-1转染组与pGFU6neo-NC转染组相比，G0/G1期细胞所占比例增加(62.2%2.1%vs.43.1%1.5%),而S期细胞所占比例减少（19.7%0.6%vs.41.2%1.2%），差异均有统计学意义（p0.05）.,2018/10/7,21,5.沉默idl基因对p16和PCNA表达的影响Western blot检测结果显示pGFU6neo-idl-1转染组的PCNA与pGFU
12、6neo-NC组相比下降，其抑制率为(908)%(P0.05).当Idl表达量被调低后，与对照组相比，p16蛋白表达量增加，上调（826）%（p0.05）,图5。,2018/10/7,22,idl基因在多种癌细胞中高表达，包括乳 腺癌、前列腺癌和食道癌等。本实验设计了2个针对idl基因的重组载体 pGFU6neo-idl-1和pGFU6neoidl-2，但只有重 组质粒pGFU6neoidl-1能有效抑制食道癌细胞 idl基因表达。p16蛋白是INK4家族的主要成员，是肿瘤的 抑癌基因之一，其启动子含有Eboxes基序。在多种肿瘤细胞中高表达的Idl蛋白通过抑 制p16蛋白表达，使细胞顺利通过
13、G0G 1检测点。,讨论,2018/10/7,23,研究结果表明：重组质粒pGFU6neo-idl一1 能特异性降低Idl蛋白表达，通过增加处于静止期 细胞数量，抑制食道癌细胞增殖。因此，idl基因可 作为食道癌基因治疗的靶点，为siRNA介导的食道 肿瘤基因沉默治疗提供实验依据。但idl基因下调 后，食道癌细胞增殖受抑制的具体作用机制及在体 内成瘤能力变化还有待于进一步研究。,2018/10/7,24,参考文献,Souza RFMolecular and biologic basis of upper gastr0intestinal malignancyesophageal carcino
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