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1、片仔癀对片仔癀对 CCL4CCL4 肝损害的保护作用研究肝损害的保护作用研究（作者：姚大卫）编者按编者按：中成药作为传统中医药的重要组成部分，为中华民族的繁衍生息、人类的身体健康做出了重大贡献。即使是在现代医学高度发达的今天，中医中药仍然如同璀璨明珠，大放异彩。中医中药的神奇疗效让人们把目光投向这块中华瑰宝。中药是中华民族的宝贵财富,中药现代化是中药科学发展的必由之路。为传承、发扬中医药文化，漳州片仔癀药业与香港中文大学姚大卫教授合作，开展片仔癀保肝作用机理的研究。该项目被列入香港创新及科技基金项目，是内地第一个中药品种被列入、并获得无偿提供的专项研究资金。片仔癀保肝研究取得积极成果，研究论文
2、发表在世界著名的丹麦医学杂志药理与毒理，引起西方医学界的极大关注。研究证明：片仔癀对肝损害有显著的保护作用，且其保护肝脏的作用可能通过刺激肝细胞重要信号传导通道各种反应因子而产生。作者简介作者简介：姚大卫，英国皇家生物学院院士、英国皇家卫生学院院士、英国动物学院院士、美国解剖学院院士，香港中文大学生物医学学院终身教授。片仔癀对片仔癀对 CCL4CCL4 肝损害的保护作用研究肝损害的保护作用研究摘要：目的探讨片仔癀对肝脏保护作用的机理。方法：以四氯化碳造成小鼠急性肝损伤为模型，观察片仔癀的保肝作用，并利用分子生物技术，通过肝细胞的培养来测定片仔癀对重要信号传导因子的作用，以了解片仔癀保肝作用机理
3、。结果片仔癀可显著减轻四氯化碳对肝的损害，可显著降低其血浆 ALT 和 AST 水平，肝脏组织学改变明显减轻能够刺激肝细胞使反应因子 API、CRE、NFKB 形成增加。结论片仔癀有明显的保肝作用，其作用机理可能通过调整肝细胞的重要信号传导通道的活动能力而取得的。关键词：片仔癀；保肝作用；机理 i 信号传导片仔癀主要由三七、蛇胆、麝香、牛黄组成，具有清热解毒、活血化瘀等功效。近几年国内外许多人应用片仔癀治疗急、慢性肝炎取得很好的效果，且最近对肝炎的治疗提出了新的中医观点：采用活血化瘀法进行治疗的原则，而片仔癀不仅是很好的活血化瘀药而且又有很好的利胆作用。为了考察其作用，以确证其疗效并运用分子生
4、物技术研究其作用机理，为该药作用提供有力的依据，本文特对其保肝作用机理进行研究，现将研究结果报告如下。1 试验材料11 片仔癀 由漳州片仔癀药业股份有限公司提供，用时研磨成试验所需的相应浓度的悬浊液，4贮存备用。12 四氯化碳(CCL4) 分析纯，临用时用豆油配成溶液，Dose：2.37mg/g13 AST and ALT 试剂 Sigma 公司。14 测试 AST and ALT 仪器 UV 1601 Spectrophotometer。15 实验动物 ICR 小鼠由香港中文大学实验动物部提供，重约2227g SPF 级2 实验方法21 急性肝损伤 取体重 2428g 的雄性小鼠 30 只，
5、实验前，小鼠禁食不禁水 6h，按体重随机分成 3 组，每组 l0 只小鼠，分设空白对照组、CCL4组、片仔癀组(O.5g/kg)。片仔癀组每 12h 灌胃给药 1次，每次灌胃容量均为 0.1ml10g，共绐药 4 次。空白对照组和模型对照组同时灌服等容量的生理盐水。在第三次给药后 1h，除空白对照组小鼠外，其它两组小鼠按 2g/g b.w 的 CCL4腹腔注射 5O% CCL4玉米油溶液。于 12h 后各组再给药 1 次。然后于 ip.CCL4后24h，各鼠取血，测定血清 ALT 和 AST，取肝脏作进一步处理。结果(见表 1)取肝脏，从每个肝脏样品中各切出大约 lcm 大小的小块立刻置于 1
6、0%甲醛中，以备做切片。取这些小块在一系列升级酒精中脱水，之后在二甲苯中清洗。再把小块包埋在石蜡中，用切片机切成 8m 厚的片段，用苏木精和伊红给这些片段染色。在显微镜下观察各鼠的肝细胞情况。结果见病理报告。图 1 小鼠肝细胞情况a 正常组 b 片仔癀组 c CCL4组 d 片仔癀组+CCL4组22 利用分子生物学技术研究片仔癀对肝细胞的保护作用机理采用分泌碱性磷酸酶化验以测定片仔癀对肝细胞的反应因子形成的影响。片仔癀对肝细胞作用的传导剖面分析是用汞牌通道剖面系统铡定的。相关因素：API、NFB、Ebox、CRE、GRE、SRE 和 HSE，这些反应因子均和一个 TAL 的促进器和分秘碱性磷酸
7、酶报告器相关连。把肝细胞播种在 96 格的培养盘中，通过 Lipofect AMINETM2000，把300ng 每单位构成物与 5OL 的 DMEM 培养基和 0.4L 的 LF2000混合传进培养盘的每室肝细胞中。传输物在传进培养盘 24h 后取出，一个培养盘加进新鲜的含有 500g/ml 片仔癀的 DMEM 培养基，一盘加进新鲜的未含有片仔癀的 DMEM 培养基。培养 48h 后，25L 的表层浮物从 96 格的培养盘每格中取出。一套 SEAP 检测剂(Clontech)用来测定在表层浮物中的碱性磷酸酶的浓度。所有的化验均在一个白色 96 格的平底微滴定盘中进行。在每个 25L 的表层浮
8、物中加进25L 的稀释缓冲液并混合均匀，混合物在 65孵化 30min，加lmM MUP3L 继续在暗室室温下孵化 60min，然后测定 SEAP 的能力。3、实验结果3.1 片仔癀对小鼠 CCL4 急性肝损伤血清转氨酶的影响（见表 1）如上表所示，CCL4 模型组小鼠的 ALT 和 AST 异常升高，片仔癀0.5g/Kg 对 CCL4 肝损害造成的转氨酶升高有显著的降酶作用。3.2 片仔癀对 CCL4 急性肝损伤所造成肝组织病理变化的影响 肝脏组织病理切片观察：CCL4 模型组，肝中央静脉瘀血，周围有小叶中央性坏死，部分为小叶周围性坏死，呈点状和碎片状坏死，有灶性淋巴细胞等浸润；坏死周围有肝
9、细胞重度浑浊肿胀、脂肪变性和气球样变性，汇管区有少量淋巴细胞等浸润，肝细胞的放射状排列被破坏。而片仔癀治疗组，被破坏的肝组织得到部分恢复，中央静脉周围肝细胞质红染，点状和碎片状坏死极少，大部分只表现有不同程度的肝细胞气球样变性，汇管区周围肝细胞有轻度浑浊肿胀，显示由 CCL4 引起的毒性已大大减少（见图 1a、b、c、d）。3.3 片仔癀对肝细胞重要信号传导通道各种反应因子的影响（见图2）。从上图所示表明，片仔癀 500g/ml 能显著增加 AP-1、CRE 及NFB 反应因子水平，但对 GRE、HSE、NFAT 及 SRE 反应因子未能产生有意义的反应。4、讨论这个研究中，我们仔细观察了片仔
10、癀对 CCL4引起肝损伤的保护功能。组织观察显示 CCL4引起肝脏细胞广泛的坏死变化，但若在小鼠受到 CCL4侵害之前，给小鼠喂食片仔癀，这些坏死变化大大减少，研究结果表明片仔癀能够保护肝脏免受肝毒素的损害。肝功能测试也显示片仔癀能够保护肝脏：小鼠在受到 CCL4侵害后，血清中的ALT 和 AST 水平均异常地高，而预先喂食片仔癀的小鼠这种水平却大大降低。为了进一步了解片仔癀的保肝作用，我们用解剖技术研究了片仔癀对重要信号传导反应因子的影响，以便了解片仔癀治疗作用的分子机理。研究发现片仔癀能够刺激 AP-1、CRE 及 NFB 反应因子，这些因子在细胞的活动中起着重要的调整作用。细胞质中 NF
11、B 转进细胞核总是和细胞生存相联系的。曾报道过在部分肝切除后NFB 受抑制导致肝细胞相分离和肝功能降低，因此片仔癀提升NFB 能力，可能是保护肝脏免受毒素损害的原因之一。AP1 是异二聚物形态，由 Fos 和 Jun 族抄写因子成员间组成，现在研究发现AP1 的活动能力对肝脏再生起着关键作用，片仔癀能够刺激 AP1 反应因子，这可能是保护肝脏免受 CCL4 损伤的另一个原因。CRE 的作用目前还不清楚，有报道它其中一个功能是在肝再生过程中调节LDHA 基因。总之，通过上面研究发现片仔癀能够对 CCL4 引起的肝损害有显著的保护作用，且其保护肝脏的作用可能通过刺激肝细胞重要信号传导通道各种反应因子而产生的。本实验由香港中文大学生物医学学院医学解剖系前主任、英国皇家生物学院院士姚大卫教授负责完成，本文系姚教授发表在著名国际医学学术期刊丹麦的药理与毒理杂志的中文翻译。
