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1、WHO狂犬病疫苗规程,董关木,狂犬病疫苗修订的基本依据,RECOMMENDATIONS FOR INACTIVATED RABIES VACCINE FORHUMAN USE PRODUCED IN CELL SUBSTRATES AND EMBRYONATED EGGS以细胞基质和胚蛋生产的人用灭活狂犬病疫苗推荐意见1. Requirements for rabies vaccine for human use. In: WHO Expert Committee onBiological Standardization. Thirty-first report. Geneva, World
2、Health Organization,1981, Annex 2 (WHO Technical Report Series, No. 658). 2. Requirements for rabies vaccine (inactivated) for human use produced incontinuous cell lines. In: WHO Expert Committee on Biological Standardization.Thirty-ninth report. Geneva, World Health Organization, 1987 (WHO Technica
3、lReport Series, No. 760). 3. Requirements for rabies vaccine for human use. In: WHO Expert Committee onBiological Standardization. Forty-third report. Geneva, World Health Organization,1994, Annex 4 (WHO Technical Report Series, No. 840). 4. Requirements for rabies vaccine (inactivated) for human us
4、e produced incontinuous cell lines. In: WHO Expert Committee on Biological Standardization.Forty-third report. Geneva, World Health Organization, 1994, Annex 5 (WHOTechnical Report Series, No. 840),WHO狂犬病疫苗修订要点,哺乳动物神经组织疫苗不例入本规程，也不再在其他任何WHO的文件中进行考虑。,WHO狂犬病疫苗修订要点,基于小鼠保护试验的NIH效力测定方法认为是可靠的方法； 对单一稀释法的改良N
5、IH资料的评估认为将发展成为标准方法，该方法已大量应用于兽用疫苗的批签发，但对人用疫苗仍在试验阶段。该方法尚须更多的资料支持和标准的试验程序,WHO狂犬病疫苗修订要点,根据1998年颁布的生产生物制品之用的传代细胞特性规程WHO推荐使用传代细胞时每一人用剂量的疫苗中宿主细胞DNA残余量为10ng与1996年一样， 减少TSE的污染风险【8】和血液制品更新规程【9】包括用人血白蛋白作为保护剂。 近年来对于柳硫汞使用的安全性关注日益提高尤其是给婴儿使用的疫苗，这些关切主要基于来源于慢性暴露在食物链的甲基汞的毒性资料， 关于柳硫汞的毒性关切是理论上的，在疫苗中使用的安全性问题没有确切的科学证据，WH
6、O在这个问题上的观点是清楚的，将继续推荐在全球免疫计划中所用的疫苗使用柳硫汞，因为使用柳硫汞的产品的利益远比其理论上的毒性风险高。,WHO狂犬病疫苗修订要点,1、近来的研究证明灭活疫苗中的糖蛋白和核蛋白在疫苗的保护效果中起重要作用。 2、鉴于此理由，委员会指定第5批标准品中含有 10IU的PM株糖蛋白和135IU的PM株的核蛋白。,WHO狂犬病疫苗术语定义,病毒主种子批：物理学上具有同质性的一定数量的病毒并制备成单一的批，用于制备工作种子批病毒工作种子批：从主种子批制备而来的一个种子批，从主种子批传代不超过5代，传代次数和传代方法均得到NRA的批准。,WHO狂犬病疫苗术语定义,细胞种子：人或动
7、物来源的性能良好一定数量的细胞，该细胞来自单一的组织或细胞制备并均一的分装在容器中，储存与100以下。 主细胞库：一定数量特性一致来源于人或动物源均一的分装成容器并冻存于液氮，该细胞来自于细胞种子；该细胞库的一支或多支细胞可用于工作细胞库的制备。 工作细胞库：来自于主细胞库的一支或多支细胞制成的均一的一定数量，可用于生产细胞培养，细胞库由系列次代传代（适宜的群体倍增）扩增后建立，从合并细胞液制备的细胞库中的一支或多支冻存管的细胞可用于生产细胞培养。,WHO狂犬病疫苗术语定义,生产细胞培养：从工作细胞库来的一个或多个容器，或者来自于一只或多只动物的组织所制备并收集到一起的细胞培养物 外源因子：包
8、括细菌、真菌、支原体和无意中进入的内源和外源病毒等污染的微生物。 单一病毒收获液：由同一批工作种子批接种在一组胚蛋或者同一生产周期制备的细胞培养，经培养，收获在一起。从同一生产细胞培养中多次收获液可以合并可以考虑为单一收获液。,WHO狂犬病疫苗术语定义,纯化原液：是半成品制备前经灭活、纯化处理后的单一收获液的合并液，可以由一个或多个单一收获液制备合并，可以生产一批或多批半成品。 半成品：经配制完成后待分装的材料，该待分装材料具有同质性,WHO狂犬病疫苗 生物安全等级,狂犬病毒被确定为2类风险病毒，因此生产疫苗的设备、仪器、操作和相关的工作需要生物安全II级的要求。 但是，在操作活病毒和/或暴露
9、于大量的病毒和/或高滴度病毒，或暴露于气溶胶时可能需要生物安全III级以保证安全级别。 从生产设施到外环境的病毒泄漏风险要降低到最小限度。,WHO狂犬病疫苗 关于地鼠群的要求,经NRA批准的在封闭笼所内饲养的健康种群所产的1014天地鼠肾用于疫苗生产，封闭的种群应由专门的管理人员，该动物的管理人员不应接触其他动物种群，动物应按规定的试验保证无特定病原体，包括无这些特定病原体的抗体。当新的动物引入种群应当隔离检疫至少2个月以显示无特定病原体。作过其他动物试验目的的亲代动物或子代动物均不得用于疫苗生产。种群应当检测动物病毒和定期测定是否污染。,WHO狂犬病疫苗 关于地鼠群的要求,当动物种群建立后，
10、所有基础动物检测以下病源微生物抗体应阴性： 结核分枝杆菌、淋巴瘤病毒、乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒和逆转录病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、呼肠孤病毒3型、小鼠微小病毒、仙台、汉坦病毒、 SV-5、Toolans H-a、鼠脊髓灰质炎、小鼠肝炎病毒、基尔汉大鼠病毒。 上述病毒应当用HAP、MAP 和 RAP进行检测，逆转录病毒还应当用敏感的PCR测定逆转录酶的方法。逆转录酶结果阳性时应作出合理的解释，因为逆转录酶可能由非编码的基因组表达逆转录病毒样物质所致。 对逆转录病毒的核酸扩增试验也应使用；为了种群的资质应选择一定数量的地鼠组织，尤其是肾脏用PCR检测多瘤应定期检测。,WHO狂犬病疫苗 关
11、于地鼠群的要求,种群建立后，应当取一定数量的动物进行监测，用于监测的试验和试验程序以及选择代表动物的数量应得到NRA的批准。所有死亡动物均应确定死因，一旦由于感染因子导致应告知NRA和疫苗生产企业应当停止使用。一旦这种情况发生，在彻底调查清楚并保证不再次在生产中出现感染以前不得开始生产，直到NRA批准为止。,WHO狂犬病疫苗 人传染性脑病安全性,人血清不得用于疫苗生产，使用的人白蛋白应符合血液、血液成分和血浆的采集、生产和质量控制规程的要求；还须符合现行的WHO人传染性脑病的指导原则的要求,WHO狂犬病疫苗 添加剂的协调使用,使用的人血白蛋白作为细胞培养的成分应仔细考虑其效期是否与狂犬病疫苗预
12、期的储存期相适应。经NRA核准可应用最低浓度的如卡那霉素、新霉素；当病毒收获以后不得再加入任何抗生素。,WHO狂犬病疫苗 原辅材料的安全性,使用动物原性的胰酶用于细胞培养应当测试细菌、真菌、支原体和感染性病毒，尤其是牛和猪的细小病毒，检测方法应NRA核准。 假如使用了牛原性胰酶应当由NRA批准，其质量标准应当符合WHO相关动物传染性脑病指导原则的要求。,WHO狂犬病疫苗 生产用毒种的要求,疫苗生产毒株应当应用包括单抗在内的血清学和分子生物学等方法进行验证，还应当包括动物攻击，另外对主种子批或工作种子批至少对糖蛋白和和蛋白进行序列测定。 全部主毒种和工作毒种应当完全符合现行WHO相关动物传染性脑
13、病指导原则的最低风险的要求,WHO狂犬病疫苗 生产用毒种的要求,工作种子批从主种子批制备的传代不得超过5代，特性应当完全一致，疫苗生产的毒种应当来自工作种子批且不得再有任何插入性传代。液体毒种必须冻存于-60 以下。 全部主毒种和工作毒种应当完全符合现行WHO相关动物传染性脑病指导原则的最低风险的要求,WHO狂犬病疫苗 病毒滴定动物症状的判定,以前推荐体内病毒滴毒终点是以小鼠死亡进行判定，现在认为应以小鼠到达麻癖症状（将小鼠处死）可判定终点，小鼠未出现耸毛、行动缓慢、摇晃运动或麻癖等狂犬病症状的应观察14天。病毒的最低滴毒应依据各个企业的生产，细胞、病毒株的特性确定。,WHO狂犬病疫苗 生产用
14、传代细胞要求,应当对二倍体细胞或传代细胞在疫苗产出水平时的细胞进行细胞鉴别试验： 鉴别试验应当包括但不限于生物化学（同功酶分析）免疫学方法（HLA分析）细胞遗传试验（染色体标记分析）基因标记分析（DNA指纹图）,WHO狂犬病疫苗 疫苗指标,抗原含量测定 对半成品应当进行适宜的糖蛋白抗原作为抗原含量测定，可以用免疫单扩散和EIA试验，选择试验所用的抗体和其他试剂是非常重要。 病毒滴度检测 病毒滴度是检测产品质量一致性的适宜指标，应当建立自己的滴定方法。,WHO狂犬病疫苗 残余细胞DNA含量测定,残余细胞DNA含量测定 对于病毒在传代细胞中扩增的疫苗，纯化原液应当进行残余细胞DNA 测定，疫苗的纯
15、化过程应当能显示宿主细胞DNA的量能稳定的去除，Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals. In: WHO Expert Committee on Biological Standardization. Fortyseventh report. Geneva, World Health Organization, 1998, Annex 1 (WHO Technical Report Series, No. 878)中规定，细胞DNA含量每纯
16、化的人用剂量应小于10 ng。测定方法应当由NRA批准，但残余DNA的水平应当顺应WHO现行细胞基质的规范。,WHO狂犬病疫苗 疫苗指标,残余物质要求 每个生产企业应当验证产品中对任何残留物可接受的水平，可以在每一病毒纯化液中检测或用生产工艺进行验证。,WHO狂犬病疫苗 疫苗病毒灭活,病毒的灭活 用于病毒灭活的灭活剂方法应当验证和由NRA批准，要考虑病毒出现聚集时可能导致灭活无效，应当高度关注并被免发生，如不能确认是否影响灭活效果时应当除去病毒聚集物后再灭活。 每一批纯化液在加防腐剂和其他物质以前作灭活试验，灭活试验应当在灭活后立即进行。,WHO狂犬病疫苗 疫苗病毒灭活,加入灭活剂后试验不能马
17、上进行应当将样品放置-60以下，而且该贮存条件应当以病毒滴度不下降的标准进行验准，未经灭活的产品应放置在相应的生物安全级别的条件下。,WHO狂犬病疫苗 疫苗病毒灭活,检测是否存在活病毒，应当用细胞培养的方法进行狂犬病毒的扩增试验，企业应当努力用Vero, BHK21，和成神经瘤细胞等对狂犬病毒高度敏感的细胞作扩增试验。,WHO狂犬病疫苗 疫苗病毒灭活,每批待测样品至少取25ml 或相当于至少25个人用剂量的样品接种5个与疫苗生产相同的细胞瓶或比该细胞更敏感的细胞，每ml疫苗样品至少接种3 cm2 细胞片。吸附一定时间后，加培养基但不得超过疫苗接种量的1:3。培养观测至少21天，细胞可以用直接荧光染色检测病毒。另外，在培养到14和21天时的每一个培养瓶中取5ml样品合并，用此合并液0.03ml脑内注射1215克小鼠20只，观察14天。任何出现狂犬病症状的小鼠应当用直接荧光法确认。观测期末应无任何细胞病变。,
