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1、2018/10/5,1,刚地弓形虫,Toxoplasma gondii,张*,2018/10/5,2,一 概 述 (Instruction),弓形虫(T.gondii)是猫科动物的肠道球虫，1908年由法国学者在北非刚地梳趾鼠的肝脾单核细胞内发现命名刚地弓形虫。弓形虫呈世界性分布，人和许多动物都能感染，全世界有25%50%人受感染，我国阳性感染率为5%20%，部分地区高达30%以上。,2018/10/5,3,专性细胞内寄生,弓形虫的整个发育过程经历无性生殖和有性生殖两个世代的交替。猫科动物为终宿主，有性生殖只限于在猫小肠上皮细胞内进行。无性生殖阶段可在肠外其它组织、细胞内进行。哺乳类、鸟类、人
2、等都可作为中间宿主，（除红细胞外）有核细胞都可寄生，只能无性生殖。,虫体侵入宿主细胞后，在宿主机体免疫功能正常的情况下，弓形虫速殖子在细胞内的增殖速度逐渐减慢，最终转化为缓殖子并形成包囊，宿主通常表现为无明显症状的隐性感染。当宿主免疫功能下降时，缓殖子活化为速殖子，迅速增值并扩散，破坏宿主细胞，引发脑炎、淋巴结炎等多脏器损伤弓形虫病，严重者可导致死亡。,机会致病性原虫,2018/10/5,5,二 生活史,包囊,假包囊,卵囊,缓殖子,速殖子,子孢子,假包囊 （有核细胞）,速殖子,包囊 （组织细胞内）,缓殖子,人等中间宿主吞入,侵入肠壁,随血液淋巴侵入 有核细胞,胎儿,免疫功能正常,免疫功能,进入
3、血流进入新的组织细胞内,脑、心、肝、肺、肌肉、淋巴结,猫等终宿主吞入,速殖子 缓殖子 子孢子,小肠上皮细胞,裂殖子,雌雄配子体,雌雄配子,合子,卵囊,经胎盘,1 滋养体（速殖子）,滋养体为中间宿主有核细胞内分裂繁殖的虫体，又称速殖子。呈香蕉形或新月形，一端钝圆，一端较尖。一侧较平，另一侧较弯曲。虫体大小约（47）微米（24）微米。几个到十几个速殖子被宿主细胞膜所包绕形成假包囊。,2 包囊,见于宿主组织中，呈圆形或椭圆形，外有一层由虫体分泌的和富有弹性的紧韧囊壁所包绕，随着囊内虫体缓慢增殖，直径5-100微米不等，内含数百虫体。在包囊内缓慢增殖或相对静止的阶段称缓殖子。,3 裂殖体,裂殖体在终宿
4、主猫科动物的小肠绒毛上皮细胞内发育增殖。虫体为长椭圆形，细胞质色浅，内含440个裂殖子，裂殖子呈新月形，在裂殖体内呈扇状排列，前端较尖，后端较钝。,4 配子体,配子体有雌雄之分：雄配子体呈卵圆形，直径10um，成熟雄配子体内含12-32个雄配子，雄配子近似新月形，两端尖，长约3um。雌配子体呈圆形，染色后呈深红色，较大的核，位于虫体一侧，雌配子体发育成熟后，虫体略变大，可达15-20um，称为雌配子。,5 卵囊,为雌雄配子结合后形成的合子发育而成。圆形或橢圆形，大小12um 10um，有两层光滑透明的囊壁，卵囊随宿主粪便排到体外，在适宜温度、湿度下迅速发育并孢子化，24h即可发育成熟，成熟时含
5、有2个孢子囊。,2018/10/5,11,滋养体 trophozoite （又称速殖子） 假包囊,包囊 cyst 含缓殖子,卵囊 oocyst,2018/10/5,12,速殖子电镜,三 基因组成和核苷酸的合成代谢,（一）弓形虫的基因组 1 染色体DNA除受精的大配子外，弓形虫各期染色体DNA均为单倍体，约含70Mb，9.610-16g。染色体组DNA中G+C含量约占55%，为没有甲基化的碱基。 2 线粒体DNA为环状双链，长度36kb，有一个10kb的反向重复序列。编码虫体代谢过程中与呼吸链相关的物质，还可能编码虫期转化的有关物质。,3 质体DNA呈环状，大小为35kb，可能编码DNA依赖的R
6、NA聚合酶亚单位和及核糖体RNA小亚单位。 4 弓形虫RNA主要有3个组分，分别为24S、19S和5S。,（二） 核苷酸合成代谢,1 嘌呤核苷酸合成代谢弓形虫不能进行嘌呤核苷酸的从头合成，需要宿主细胞提供外源性的嘌呤，虫体才能进行核苷酸的合成。在细胞内寄生的虫体主要依靠次黄嘌呤补救途径获得嘌呤。这可能是弓形虫专性细胞内寄生的原因。 2 嘧啶核苷酸合成代谢弓形虫能进行嘧啶核苷酸的从头合成，也能通过嘧啶补救途径从宿主细胞的核苷酸池获得。,四 主要基因和蛋白质,（一）主要基因 1、B1 基因是一个前后重复的35个拷贝的基因，据cDNA序列分析，在456-843bp区域内有一个内含子，此区域有规范的5
7、和3剪切位点序列，被广泛用于弓形虫的检测研究中。 2、P22基因（SAG2）是速殖子基因组中的单一拷贝基因，长度1404bp，内含597bp开放阅读框，为完整的翻译序列，内含多个重复的终止密码子。,3、P30基因（SAG1）单一拷贝，不含内含子，分子量大约为34700 ，编码蛋白质序列为319氨基酸。 4、ROP1基因为2.1kb的单一拷贝ROP1的mRNA全长2155nt，核苷酸序列86-143之间可能存在一个内含子。,（二）主要蛋白质功能,1、P30（SAG1）P30蛋白占速殖子全部蛋白质的5%，是弓形虫速殖子侵入宿主细胞与细胞受体结合的重要虫体配体，速殖子与宿主细胞的粘附作用，可以被抗P
8、30单克隆抗体6A8所抑制，单克隆抗体6A8的Fab片段也能抑制虫体的粘附作用，而且具有计量依赖性，P30分子构象的变化，能影响虫体对宿主细胞的粘附作用。,2、P22(SAG2)和P43（SAG3）P22(SAG2)和P43（SAG3）在虫体胞膜位置上与P30靠近，能协助P30使虫体迅速入侵。用抗P22单克隆抗体，速殖子与宿主细胞共同卵育，虫体在宿主细胞外堆积，延缓对宿主细胞的附着。当抗体压力解除后，堆积的虫体侵入细胞的活动力增强。,3、ROP1ROP1在弓形虫侵入宿主细胞的过程中起到了PEF的作用，当某些蛋白质因子或介质作为PEF能增加侵入的有效性，而单克隆抗体Tg49既能抑制PEF，也能识
9、别ROP1，所以认为ROP1就是PEF。,3、致密颗粒蛋白是弓形虫分泌排泄抗原的重要组成部分，在修饰调理弓形虫纳虫泡结构中起重要作用。 4、微线体蛋白由弓形虫虫体前端散布在棒状体周围的微线体分泌的、属于成员众多的家族蛋白质。在弓形虫粘附、侵袭宿主细胞期间，虫体的滑行移动和侵入宿主细胞都与信号分子介导的钙依赖激酶等调节、肌动球蛋白作用微线体蛋白的释放有关。 分类：1、具有跨膜性质的微线体蛋白MIC2、6、7等2、不具跨膜特性的可溶性黏附蛋白MIC1、3 、4、5等,2018/10/5,22,五 致 病 (pathogenesis),免疫力正常隐性感染（无临床症状）免疫力低下致死性弓形虫病,1.
10、致病特点,虫株毒力:强毒株、弱毒株 宿主免疫状态,2. 致病机理,急性期 速殖子增殖作用,慢性期/隐性感染包囊占位挤压作用,2018/10/5,23,胎儿先天性畸形,3.临床表现, 先天性弓形虫病,母亲孕期感染,50%胎儿先天感染,如脑积水、无脑儿、视网膜脉络膜炎、弱智等或流产、早产、死产等。,2018/10/5,24,（2）后天获得性弓形虫病,免疫力正常隐性感染免疫力低下全身性弓形虫病,引起脑膜脑炎、视网膜脉络膜炎 淋巴结炎、肝炎、心肌炎、肺炎,六 疫苗,1、全虫疫苗（1）灭活苗由致死的全虫或全虫裂解物制成。优点：安全性比较高；缺点：免疫原性低。（2）减毒或弱毒苗将病原微生物在训育条件下使其
11、产生定向变异，极大降低致病性，但仍保留一定的毒力、免疫原性和繁殖能力，可刺激机体产生细胞和体液免疫应答，但此类疫苗仍具有潜在回复突变而恢复毒力的危险，故不适于人类。,2 虫体特异组分疫苗,是利用虫体排泄和分泌性抗原或速殖子膜抗原特定组分制备的疫苗，虫体排泄和分泌抗原直接暴露于宿主免疫系统，因而可以激发宿主产生体液免疫和细胞免疫，而速殖子膜抗原是诱导宿主免疫应答的主要靶抗原之一。利用弓形虫抗体蛋白与免疫刺激复合物免疫猪，可产生很高的IgG抗体水平，但抗体水平不足以抵抗大剂量虫体攻击。,3 基因工程疫苗,是利用基因工程方法或分子克隆技术，分离出弓形虫的保护性抗原基因，通过原核或真核系统表达出保护性
12、抗原，制成疫苗。分为重组单价疫苗和复合多价疫苗。,重组单价疫苗是将弓形虫的单一保护性抗原基因通过原核或真核系统表达纯化后制成疫苗。 复合多价疫苗是将不同抗原分子设计成联合抗原或编码不同抗原分子的功能性表位氨基酸的基因片段连接起来，通过原核或真核系统表达出联合抗原或联合表位肽段。,4 核酸疫苗,包括DNA疫苗和RNA疫苗，是将含有病原生物的某种抗原的cDNA或mRNA与特定载体的重组体，作为抗原直接接种动物和人，核酸进入细胞内，表达编码抗原，激活免疫系统产生抵抗病原侵入或致病的免疫力。 与其他疫苗相比有如下优点：制备方法简单，可大量生产，保存方法多，便于储存和运输，可诱生体液和细胞免疫，免疫应答
13、维持时间持久。 缺点：将DNA意外导入非靶细胞内，影响细胞正常功能；刺激被接种机体产生抗DNA抗体，有导致自身免疫的可能；质粒DNA整合到机体的遗传系统内会引起细胞癌变；产生免疫耐受的潜在可能。 其他新型疫苗：目前出现了一些新型疫苗：多糖疫苗、化学合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗等。,2018/10/5,29,1、病原学诊断 涂片染色法,七 实验诊断(diagnosis),取急性期患者的体液、脑脊液、 骨髓、羊水、胸水等离心后，沉淀物 作涂片，姬氏染色镜检查滋养体。,2018/10/5,30, 动物接种分离法或细胞培养法将样本接种于小白鼠腹腔内，1周后取腹腔液镜检。样本也可接种于离体培养的单层有核细胞。查找滋养体。,2018/10/5,31,3、基因诊断PCR及DNA探针灵敏、特异、早期诊断,2、免疫学诊断, 染色试验（DT） 间接血凝试验（IHA） 间接免疫荧光抗体试验（IFA） 酶联免疫吸附试验（ELISA）,2018/10/5,32,八 防 治, 加强家畜、家禽的管理 严格肉类及制品的检疫 教育孕妇远离宠物不养猫，不玩猫 做好产前检查,治疗：磺胺类 乙胺嘧啶磺胺嘧啶孕妇首选 螺旋霉素,重在预防：,谢谢！,
