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1、单克隆抗体的 制备和应用,基础部免疫教研室 金伯泉,20世纪有关抗体的生理学和医学诺贝尔奖项,Niels K. Jerne,Georges J.F. Khler,Csar Milstein,B淋巴细胞杂交瘤技术是如何创立的,应用SRBC为免疫原免疫小鼠为模型, 观察抗体 产生细胞的体细胞突变(Somatic mutation),导致了在生命科学领域中的一场革命,克隆（Clone）又名无性繁殖系，指由一个祖 先细胞经分化、增殖所产生的遗传性状完全相 同的细胞群,多克隆抗体（Polyclonal antibody, pAb） 用包含多种抗原决定基的抗原物质免疫动 物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对
2、多种抗 原表位的不同抗体的总和，称为多克隆抗体 单克隆抗体（Monoclonal Antibody, mAb） 由一个杂交瘤细胞克隆所产生的，针对单一抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体,单克隆抗体的优点,单特异性和均一性,无限供应,用混合的抗原制备出识别一个抗原决定簇的抗体,杂交细胞（hybrid cell）在外界某些条件干预下（如PEG、电穿孔），当两个细胞紧密地接触的时候,其细胞膜可能发生融合，产生具有原来两个细胞染色体/基因的单个细胞，称为杂交细胞,杂交瘤细胞（Hybridomas）若用一种肿瘤细胞与另一种体细胞（如淋巴细胞）融合，所形成的杂交细胞称为杂交瘤细胞，简称杂交瘤。其既具有肿瘤细
3、胞无限增殖的能力，也具有淋巴细胞的一些特性B淋巴细胞杂交瘤骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合所产生的杂 交瘤细胞,B淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理,B细胞,骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞,抗原制备 免疫动物 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合 杂交瘤细胞的选择培养 杂交瘤细胞的筛选及克隆化 单克隆抗体的鉴定 单克隆抗体的制备,单克隆抗体制备的主要步骤,一、抗 原,细胞、细菌和病毒等，一般具有较强的免疫原性，可不加佐剂。例如，直接腹腔注射12107个细胞。,颗粒性抗原：,可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在原核或真核细胞内表达。可溶性抗原需与弗氏完全或不完全佐剂混匀，进行免疫。,可溶性抗原：,B淋巴
4、细胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特异性抗体的B淋巴细胞，有利于细胞融合形成分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。多次免疫可通过抗体亲和力成熟机制，使B细胞分泌高亲和力抗体，由此形成的杂交瘤往往可分泌高亲和力抗体，有更高的应用价值。,二、免疫动物,免疫目的：,采用与骨髓瘤供体同一品系的动物 免疫动物品系（脾细胞供体）和骨髓瘤细胞 在种系发生上距离越远则产生的杂交瘤越不稳定，获得的杂交瘤不能在该品系小鼠体内诱生腹水。,动物的选择：,动物对抗原刺激易产生免疫应答反应,8 12周龄雌性小鼠（最常用BALB/c）,第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂,第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐剂,第三次免疫：
5、可溶性抗原加生理盐水,小鼠背部皮下注射,小鼠背部皮下注射,4周后,3周后,小鼠腹腔注射,10天后,检测血清效价,加强免疫：可溶性抗原加生理盐水,小鼠腹腔注射,细胞融合,3天后,免疫程序：,所选择的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物 品系相同,三、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备,骨髓瘤细胞系的选择要点：,自身不产生免疫球蛋白的重链与轻链,对氨基碟呤敏感,与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌Ig杂交瘤细胞,饲养细胞的作用：,小鼠腹腔巨噬细胞 小鼠脾细胞,饲养细胞（feeder cell）：,增加细胞密度，满足新生的杂交瘤细胞对细胞密度的要求 吞噬清除死亡的细胞分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长,饲养细胞的
6、种类和制备方法：,四、细胞融合,融合前的准备工作,准备HAT、HT培养液、融合剂PEG 准备饲养细胞 准备骨髓瘤细胞 准备免疫脾细胞,拉颈处死小鼠 无菌操作取出脾脏 清洗、研磨 收集细胞 离心洗涤 细胞计数,脾细胞的准备,收集细胞 离心洗涤 活细胞计数 调整细胞浓度,骨髓瘤细胞的准备,细胞融合,骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合1: 10或1: 5加入促融剂PEG,PEG,在聚乙二醇作用下B淋巴细胞可与 骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞,五、杂交瘤细胞的选择性培养,HAT选择性培养的原理：细胞的DNA生物合成有主要途径和补偿途径。当有氨基碟呤存在时，能够阻断DNA合成的主要途径，需通过补偿途径
7、合成DNA，这时就需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用次黄嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。,用于杂交瘤融合的骨髓细胞缺乏HGPRT和TK，在HAT培养液中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT和TK ，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的B淋巴细胞虽具有HGPRT和TK ，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合的杂交瘤既有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又从免疫B细胞得到HGPRT和TK 的基因产物，因此，能够克服氨基碟呤的阻断作用，通过次黄嘌呤的补偿途径合成DNA，而在HAT选择培养液中生长繁殖。,融合后34天
8、后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。融合后第79天取培养上清，检测特异性抗体。,细胞生长情况,六、杂交瘤细胞的筛选及克隆化,杂交瘤分泌单克隆抗体的检测方法,免疫酶技术间接ELISA 包被抗原、培养上清、酶标抗体、加底物显色 阴性对照：骨髓瘤细胞培养上清 阳性对照：免疫鼠血清免疫荧光技术,间接免疫荧光（或酶）测定法：靶细胞铺片、固定细胞、加待测样品、加荧光标记抗体（或加酶标抗体和显色底物）、镜检活细胞免疫荧光技术：流式细胞术分析,杂交瘤细胞的克隆化,在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。克隆化即把培养孔中的细胞从单个细胞进行
9、培养繁殖，使之成为单克隆，其分泌的抗体达到均一性。,有限稀释法,软琼脂培养法以适当浓度杂交瘤细胞加入软琼脂培养 基中，形成由一个细胞增殖而成的细胞集落。,杂交瘤细胞的克隆化筛选：,免疫球蛋白类别及亚类的鉴定,七、单克隆抗体的鉴定,小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合形 成的杂交瘤细胞，其分泌的特异性McAb的本 质仍是小鼠的不同类型及其亚类的免疫球蛋白 （Ig），其中以IgG（IgG1、 IgG2a、IgG2b和IgG3等亚类）最常見，其次为IgM。,抗体亲和力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是由抗体分子结合表位部位和抗原决定簇之间的互补程度决定。,特异性 是否与其他抗原有交叉反应
10、敏感性 对腹水和培养上清进行效价测定 亲和力测定,八、单克隆抗体的制备,动物体内诱生法取Balb/c小鼠, 首先腹 腔注射0.5ml液体石腊或 降植烷进行预处理。 12周后, 腹腔内接种杂交 瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠 腹腔内增殖，并产生和分泌 单克隆抗体,约12周, 可见小鼠 腹部膨大。用注射器 抽取腹水，即可获得 大量单克隆抗体。,将杂交瘤细胞置于培养瓶（或灌）中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体。收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体，不含无关Ig，但成本髙。,体外培养法,我国单克隆抗体的发展历史和前景,早期研究阶段 全军单克隆抗体研究协作组（
11、单克隆抗体通迅） 应用和市场化 HLDA HCDM 功能基因组研究中的重要地位 国家重大科技项目（973、863等）主要研究内容之一,单克隆抗体的应用,基础理论研究（生命科学） 发病机理的研究 疾病的预防（紧急预防） 疾病的诊断（传染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷病） 疾病的治疗（治疗性抗体）, 一项重要的生物技术和一类生物高科技产品,单克隆抗体在生命科学和医学中的广泛应用,从医学到生命科学的各个领域从基础研究到临床应用从诊断到预防和治疗,MHC 细胞表面分子 血型 肿瘤相关抗原和分子 抗Ig的同种异型 激素、细胞因子和血浆成分 纯化干扰素 病原生物,传染性疾病 HIV:
12、急性感染期和晚期: 核心抗原p24升高; 检测抗HIV抗体初筛; 免疫印迹进一步确认; CD4+T 细胞200/l病情严重HAV、HBV、HCV: 抗体HFRS: 免疫荧光，ELISA（特异性IgM）肿瘤 多种肿瘤的标志物 直肠结肠癌:CEA 前列腺癌:PSA原发性肝癌:AFP淋巴瘤和白血病:CD分子自身免疫性和过敏性疾病 自身抗体（抗核抗体、类风湿因子） 放射免疫测定法（RIA）检测特异性IgE 甲状腺素、胰岛素、生长激素其他血型检测：凝集反应（直接和间接）早孕: 人绒毛膜促性腺激素（hCG）男性不育: 抗精子抗体,单克隆抗体在临床诊断中应用,Fab,murine antibody,chim
13、eric mouse antibody,Fv,dAb,engineered bispecific Ab,ScFv,Humanized F(ab)2,Humanized antibody,ScFv-toxin,intrabody,Number of therapeutic mAbs entering clinical study per year,Therapeutic categories for mAbs in clinical study,Characteriztion of mAbs against EpCAMby IHC and IF,肿瘤 器官移植排斥自身免疫性疾病其他,CD20,
14、CD52, CD33, HER-2 EGFR, VEGF, EP-CAMCD3, IL-2R（CD25）TNF-, CD11a, 4整合素, CD20GPb/a, IgE, RSVgpF,Mechanisms of mAb-mediated killing,CD20 表达于B 淋巴细胞，其抗体可促进细胞对化疗的敏感性，诱导细胞凋亡、ADCC、CDCCD33 表达于90% 以上的急性髓样白血病 (AML)细胞，但不表达于骨髓CD34+造血干细胞，其抗体可诱导双链DNA断裂和细胞死亡CD52 可诱导ADCC和CDC，治疗慢性B淋巴细胞白血病、T细胞白血病和T细胞淋巴瘤,白血病及淋巴瘤,抗HER2/
15、CD340 ADCC，抑制肿瘤细胞增殖和血管形成抗EGFR 阻断EGFR与EGF结合，诱导ADCC，抑制细胞增殖，抑制肿瘤血管形成，诱导凋亡抗VEGF 阻断VEGF与VEGF受体结合，抑制肿瘤的血管生长和转移部位的发展,实质性肿瘤,抗CD3 补体依赖的细胞毒作用（CDC），清除T细胞，阻断T细胞功能抗CD25 补体依赖的细胞毒作用（CDC），阻断IL-2受体,预防肾移植急性排斥反应,抗TNF 阻断TNF-与受体结合, 降低或消除由TNF-刺激细胞所发生的炎症反应抗CD11a 抑制LFA-1与配体结合, 抑制白细胞黏附, 治疗斑状牛皮癣抗4整合素 抑制VLA-4与配体结合, 抑制白细胞黏附 CD20 治疗RA,自身免疫性疾病,抗IgE 阻断IgE与IgE受体结合, 抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒和释放介质，治疗持续性哮喘抗gpb/a 抑制血小板凝血，止血，预防冠状动脉血管形成术中血栓抗RSVgpF 中和病毒，抑制病毒融合和复制，预防儿童在高危期RSV感染,
