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1、食品质量检测新技术课程论文题题 目：目：我国转基因食品快速检测技术研究进展姓姓 名：名： 学学 号：号： 专专 业：业： 农产品加工及贮藏工程 教教 师：师： 姬华 副教授 时时 间：间： 2016 年 12 月 20 日 我国转基因食品快速检测技术研究进展摘要摘要：随着科学技术的飞速发展，社会经济不断突破新高。转基因食品进入大众生活，为我国带来了巨大的经济效益，但很多人也开始担心转基因食品的安全问题。近些年来我国转基因食品检测技术已经日渐成熟，为满足广大消费者的选择权和知情权，以及国际贸易的需要，转基因食品的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视，而各种检测技术也随之发展起来。本文介
2、绍了几种常用的转基因食品检测方法并对未来的转基因食品检测技术做了展望，通过深入的科学研究，为大众带来更加安全、健康的食品。关键词关键词：转基因食品；安全；快速检测引言引言转基因食品主要是指利用基因工程技术改变基因组构成，将某些外源基因转移到动物、植物或微生物中去，改造其遗传物质，使其性状、营养价值或品质向人们所需目标转变，并由这些转基因生物所生产的食品和食品添加剂。转基因食品也称基因改造食品或基因修饰食品(genetically modified food, GMF)1。据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001 年全世界转基因作物种植面积为 5260 万公顷，比 2000
3、 年增长 19%，其中 99%的转基因作物种植在美国、阿根廷、加拿大和中国等 4 个国家。已商品化大面积种植的转基因作物种类主要为大豆、玉米、油菜和棉花，小面积种植的有西红柿、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜等。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种2。转基因食品的快速发展一方面展示出先进科学技术在生产上的巨大应用前景，另一方面也引发了转基因食品对人体健康和生态环境影响的争论。为满足广大消费者的选择权和知情权，以及国际贸易的需要，转基因食品的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视3，而各种检测技术也随之发展起来。1 转基因食品对社会和人类的影响转基因食品对社会和人类的影响随着转
4、基因生物种类的日益繁多和全球范围内转基因食品原料种植面积的不断扩大，转基因食品成为了世界食品消费市场不可或缺的一个重要组成板块。在转基因农作物给人类社会的发展和消费需求带来巨大的经济效益的时候，越来越多的人开始考虑转基因食品的安全问题，转基因农作物的种植是否对生态环境带来潜在的影响问题等等，具体而言，这种质疑表现在，转基因生物技术的发展是否会改变新食品的成分构成，转基因食品添加剂是否对人体健康带来不良影响；转基因食品是否会影响到青少年的生长发育；新基因在转基因食品的流通中是否会影响和破坏食物链和农作物的生长环境；转基因食品是否会对自然界的生物多样性产生不利的影响等4。2 转基因食品存在的争议及
5、安全监管方面的问题转基因食品存在的争议及安全监管方面的问题转基因食品在现阶段成为了一个模棱两可的争议食品，到目前为止，转基因食品的安全问题都很难下一个确切的结论，也没有充足的证据和严肃的科学报告能够证明转基因食品的安全性、永久性和环保性，因而成为了一个全世界各国共同关注的焦点，正在实现不断市场化的转基因食品需要建立一种准确、快速的转基因食品定量检测方法和食品定性技术，来进一步完善我国转基因食品监管方面的科学规范5。常规的转基因食品评价方法其灵敏性往往比较差且耗时长，容易出现统计误差。加上我国有关转基因食品的生产规范缺乏强有力的法律体系保障，使得我国转基因食品市场出现鱼目混珠的情形，不利于保障我
6、国国民的身体健康。3 转基因食品检测技术转基因食品检测技术由于转基因物质有可能在耕种、收割、运输、储存和加工过程中混入食品，对食品造成偶然污染。因此，不论是对转基因食品贴示标签，或是对转基因与非转基因原料进行分别输送，转基因原料和食品的检测都是必不可少的；另外，要区分转基因与非转基因食品，对转基因食品进行选择性标记，对食品中的转基因含量的多少加以限制，也需要准确有效的基因检测技术。从发展来看转基因食品的检测技术根据检测的直接对象可分为三类：（1）利用导入外源基因所表达的特殊性状直接鉴定；（2）针对导入外源基因表达的蛋白质的鉴定方；（3）以导入外源基因的特定 DNA 序列为检测对象的检测技术。其
7、中目前用的比较多的是 PCR 技术、ELISA 技术和生物芯片技术三种6。3.1 PCR 技术与转基因食品检测PCR 检测技术的基本原理是根据食品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物，经 PCR 反应使待检靶标 DNA 序列得以扩增放大，最后经凝胶电泳分析靶标 PCR 产物的有无，从而对食品中是否含有靶标基因序列成分进行判定。不仅可以对转基因食品进行定性鉴别，改良后也可以对转基因成分进行定量分析。应用 PCR 技术的关键是所设计的 DNA 引物的序列必须和转基因材料或食品中待扩增的 DNA 序列互补，因此为了设计有效引物，检验者必须对转基因材料或食品中所含有的外源基因 DNA 序列有一定的了解
8、。转基因生物中被导入的外源基因序列一般包括标记基因、目的基因及各自的启动子、终止子等调控序列7。3.1.1 PCR 定性筛选检测方法1996 年德国伯恩斯坦大学的 Meyer Rolf 等论证了 PCR 检测转基因食品的可能性。到目前为止，全世界已有 30 多种转基因产品得到相关国家的安全评价，在现有的商品化转基因产品中绝大多数含 CaM35S 启动子和 NOS 终止子，两种因子常用于转基因植物的构建，这就为人们建立针对这两种成分的转基因 PCR筛选检测方法提供了便利。最近一些国外实验室已将报告基因 GUS、NPTII 基因，目的基因 CRY、CPT 等作为检测目标，力争更准确可靠检出转基因成
9、分8。3.1.2 定量 PCR 方法随着人们对转基因食品重视程度和量化要求的提高，定性检测方法已经不能满足需要，加上定性筛选 PCR 本身具有局限性，所采取的 PCR 法因其高敏感性常伴有假阳性或假阴性现象，为此，研究者们在定性筛选 PC 方法的基础上，发展了不同的定量转基因食品的 PCR 检测方法。目前转基因成分的准确定量检测在国际贸易中日趋重要。根据资料报道，目前转基因成分的定量检测方法有半定量 PCR 法、定量竞争 PCR(QC-PCR)法和实时定量 PCR 法。其中，半定量 PCR 法比较简单，但结果精密性较差；定量竞争 PCR 的特点是含有内部标准子，可降低实验室之间的检测误差；而实
10、时定量 PCR 法可在提取 DNA 后3h 内，检测样品的总 DNA 量及 2pg 转基因成分的量，但这套 PCR 系统目前价格昂贵。3.1.2.1 定量竞争 PCR 法先构建含有修饰过的内部标准 DNA 片断(竞争 DNA)，与待测 DNA 进行共扩增，因竞争 DNA 片断和待测 DNA 的大小不同，经琼脂糖凝胶可将两者分开，并可进行定量分析。实验步骤：样品 DNA 的提取和定量。按常规方法提取 DNA。DNA 含量可用紫外分光光度计测定。竞争 DNA 的构建。按常规分子生物学的方法，用基因重组技术构建竞争 DNA 片段作为内部标准 DNA，此片段除含有转基因成分外(如 35S 启动子、NO
11、S 终止子)，还插入数+bp 的 DNA 序列。标准工作曲线的建立。取定量模板 DNA，所含 GMO 量分别为 0%-100%的系列参考样，分别与一定量的竞争 DNA 在同一反应体系进行 PCR 扩增。特异转基因 DNA与竞争 DNA 竞争反应体系中的相同底物、引物，PCR 反应获得相差数+bp 的两条凝胶电泳带，两条带浓度随转基因成分含量的不同而有差异。当两条带浓度相等则说明此参考样 GMO 浓度与竞争 DNA 浓度相等。通常实验时竞争DNA 浓度调整到与含 1%转基因成分的参考样相当。通过凝胶成像分析系统对琼脂糖凝胶电泳的结果进行分析，得到每条带的相对浓度，以此数据作目标DNA 浓度目标
12、DNA 浓度/竞争 DNA 浓度的对数图，线性回归分析后得出工作曲线。待测样品的测定。将 500ng 待测 DNA 与经过定量的竞争 DNA 共扩增，凝胶电泳后经扫描分析得到目标 DNA/竞争 DNA 的比值，依此数据在工作曲线图上求得待测样品的 GMO 含量9。3.1.2.2 实时定量 PCR 法此方法须设计一个内部探针，该探针包含 5端荧光报告因子和 3端猝灭因子。PCR 反应前，由于淬灭因子与荧光报告因子的位置相近，使荧光受到抑制而检测不到荧光信号。随着 PCR 反应进行，从上游的 PCR 引物开始，引物和标记探针与目标 DNA 分子中对应的互补序列复性，聚合酶与探针相遇，利用其 5核酸
13、外切酶活性使报告因子释放，产生的荧光可被内设的激光器记录，记录到的荧光强度可反映 PCR 的产物量，从而实现实时定量分析10。PCR 检测技术灵敏度高，检测迅速，无论外源基因在受体生物中是否表达，只要其 DNA 存在，就能被检测，同时适用于加工过的转基因食品。给予启动子和终止子调控序列的检测方法无需了解产品的转基因背景即可对其进行是否含有转基因成分进行筛选鉴定。但是 PCR 检测技术操作程序繁琐，需要对样品DNA 进行提取，对某些材料可能出现假阳性，所以，对出现假阳性的样品应进行目的基因检测，同时还应选择合适的植物内源基因作为阳性扩增对照以检查核酸抽提质量。因为 PCR 检测极为灵敏，整个操作
14、过程极为严格，检测时容易遭受到污染而出现假阳性结果11。3.2 ELISA 技术与转基因食品检测ELISA 技术是建立在抗体抗原免疫学反应的基础上的。抗原抗体反应是一种非共价键特异性吸附反应，即在通常情况下，抗原只和它自己（或具有相同抗原决定簇）诱导产生的抗体发生反应，因此具有高度特异性，抗体抗原反应虽然产生肉眼可见的凝集反应，但灵敏度太低而且需要大量的抗体和抗原。美国 FDA 已研究出用双夹心 ELISA 法检测食品中是否含有转基因玉米成分12。Enviro Logix ELISA 试剂盒可用于测定玉米中的 Cry9C 蛋白，在同一实验室和实验室间共测定了 9 种含玉米的食品，测定结果的重现
15、性很好。13 个 EU 成员国和瑞典共 37 个实验室研究结果表明13，大豆干粉中转基因组织(GMO)含量为 2%，检测可信度达 99%。ELISA 分析法特异性高，获得结果很快，仪器简单，仪器操作，对人员要求不高，免去了对样品进行核酸提取的麻烦，同时可降低检测的成本。由于酶具有很高的催化效率，可极大的放大反应效果，从而使测定达到很高的灵敏度和稳定性。3.3 生物芯片与转基因产品检测就目前转基因食品检测中常用的 ELISA 和 PCR 技术而言，最大的缺点是检测范围窄，效率低，无法高通量大规模地同时检测多种样品，尤其是对转基因背景一无所知的情况下，对各种候选待检基因序列或蛋白的逐一筛查几乎是不
16、可能的14。而目前正在研究的转基因产品所涉及的基因数量有上万种，今后都有可能进入商品化生产，显而易见对进出口产品的检测，需要有更有效、快速、特别是高通量的检测方法，最近几年出现的生物芯片技术能较好地解决这一问题。转基因作物检测基因芯片是将目前通用的报告基因、抗性基因、启动子和终止子的特异片段(靶片段)固定于玻片上制成检测芯片，将从待检样品中提取的 DNA 扩增、标记后与芯片进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描后再经计算机软件进行分析判断。具有如下特点；（1）选择检测的报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，通常是在离体条件下易于检测的酶或发光蛋白，目前较为常用的有 Gus 基因和 Gfp 基因。 （2）该技术综合了 PCR 和分
