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1、 毕业论文毕业论文题题 目目乙肝表面抗原的 ELISA 法定量分析方法学验证年年 级级2011 级层次层次专科专专 业业临床医学班级班级一班姓姓 名名学号学号指指导导教教师师职称职称2014 年年 5 月月 6 日日辽宁医学院继续教育学院制辽宁医学院继续教育学院制1目 录摘要关键词英文前 言1. 材料与方法1.1 试剂盒1.2 仪器1.3 方法1.3.2铺板方案1.3.3加样步骤2. 结果2.1 标准曲线与线性范围2.2 准确度（回收率）的验证2.3 精密度的验证2.3.1 板内精密度的验证2.3.2 板间精密度的验证2.4 检测限（LOD）计算3. 讨论3.1 乙肝表面抗原定量分析的意义3.
2、2 常用定量分析方法3.3 方法概述3.4 方法学验证内容3.5 结果分析及应用评价参考文献致谢附录2乙肝表面抗原的乙肝表面抗原的 ELISAELISA 法定量分析方法学验证法定量分析方法学验证摘摘 要要目的目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的 HBsAg 的 ELISA 法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。方法方法：ELISA 法定量分析，应用试剂盒 HBsAg标准品从浓度为 8ng/ml 做 2 倍稀释的 6 个浓度梯度做标准曲线，以 6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度 5 复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。结果：结果：标准曲线R2=0.997，准确
3、度 97.07%，1.5ng/ml 的 RSD 为 16.78%，不满足 ng/ml 级水平的 RSD 一般应LOD，此标准曲线上最低浓度点为0.25，大于LOD（0.172） ，故此标准曲线线性好。3.3. 讨论讨论3.13.1 乙肝表面抗原定量分析的意义乙肝表面抗原定量分析的意义乙肝表面抗原是乙肝两对半的其中一项，乙肝两对半定性检测对乙肝疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用。但随着临床医学的发展，乙肝两对半定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求，特别是在疗效观察以及乙肝疫苗注射后抗体产生情况的观察上有明显的不足。随着检验医学的发展，乙肝两对半定量测定成为可行，大大弥补了乙肝两对
4、半定性检测的不足。而且乙肝两对半定量检测可与HBV DNA荧光测定相互补充，综合评价患者病情与药物疗效，为低含量的慢性乙肝、病毒7携带者提供了正确判断病情的依据【2】。这在目前的临床治疗中应用十分广泛。3 3. .2 2 常常用用定定量量分分析析方方法法此次实验只是对一种试剂盒的可用性进行方法学验证， 而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又称解离增强镧系荧光免疫分析，是近十年发展起来的一种微量分析方法。此技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围更宽，试剂盒货架寿命长，操作简便和非放射性等特点，成为最有潜力的一种标记免疫分析方法【
5、3】。全自动酶免分析仪目前也广泛应有，自动化、标准化的操作手段使实验达到了全过程控制和全过程标准化分析，大大提高了实验的精密度【4】，使检测结果更趋稳定，从而保证了实验结果的可靠性。3 3. .3 3 方方法法概概述述目前普遍使用的HBsAg试剂尽管在制备时采用了高亲和力的单克隆抗体，并且使包被抗体、酶标抗体的结合位点尽可能的远。以避免竞争抑制，最大程度地解决钩状效应（HOOK）的问题【5】。本次实验是对实验室的一种试剂盒，即福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验。往预先包被H
6、BsAg捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本，标准品，HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下最终转化为黄色。颜色的深浅和样品中得HBsaAg呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度OD值，计算样品浓度。应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8，4，2，1, 0.5 ，0.25ng/ml 6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做质控，进行准确度，精密度和检测限等方法学验证。选择最低浓度为0.25ng/ml的原因是因为，绝大多数HBV感染者外周血中可出现HBsAg，含量在5ng/ml 600ug
7、/ml之间，高者可达2000ugml以上【6】，满足了现阶段文献报道的最低浓度值。3.43.4 方法学验证内容方法学验证内容方法学验证内容一般包括标准曲线，准确度，精密度和检测限。标准曲线亦称校正曲线，系指生物样品中所测定的样品浓度与响应的相关性，通常用回归分析方法所得的回归方程来评件，此实验所用了6个浓度点建立标准曲线。方法准确度指待测浓度与真实浓度的接近值了，一般用相对回收率表示，限度要求在85%115%的范围内。精密度8则表示分析方法的可重复性，是对同一样品每次测定结果的一致性，用标准偏差和相对标准偏差表示，可做板内和板间的验证，对于ug/ml级水平的相对标准偏差一般应10%, ng/m
8、l级水平的相对标准偏差一般应15%。检测限则表示分析低浓度样品的能力，通常又称为灵敏度。3.53.5 结果分析及应用评价结果分析及应用评价第一组数据标准曲线R2=0.9973，显示具有良好的相关性，HBsAg 浓度为6ng/ml和3ng/ml 的回收率分别为为97.58%，符合113.07%，符合限度要求在85%115%的范围内。但是HBsAg 浓度为.5ng/ml的回收率为80.56%，显示此试剂盒对于低浓度样品的检测准确度差。在精密度方面，6，3，1.5ng/ml变异系数CV分别为12.73% ，3.69% ，3.50%，而HBsAg 6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.73%，
9、显示孔间差异较大，精密度不高，但是也符合ng/ml级RSD水平的一般应15%的要求，其中有一孔浓度为4.55，与其它孔比较差异较大，可能是由于操作引起例如加样不准不属于试剂盒的问题，故可以认为此试剂盒对于批内高、低浓度样品的检测精密度还是可以的。在做 3 个组数据的批间的精密度分析时，发现6，3，1.5ng/ml变异系数 CV 分别9.10%，12.06%，16.78%，分布方式从低到高，前2个浓度满足对ng/ml级水平的RSD一般应15%的要求。1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的 RSD 一般应15%的要求，显示低浓度的孔间重复性差，精密度不是很高。综上分析，该
10、试剂盒对于高浓度样品的检测具有良好的准确性和较高的精密度，而对于低浓度样品（1.5ng/ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。目前绝大多数 HBV 感染者外周血HBsAg浓度很低，该试剂盒不能全面检测出此类人群，故该试剂盒不能用于临床标本的检测。9参考文献参考文献【1】魏来，陶其敏努力规范肝脏疾病的免疫学诊断中华检验杂志，2003，26：6971【2】刘晓梅，张世兰HBsAg阴性结果的慢性乙型肝炎患者病毒血症水平与临床的关系J】临床检验杂志，2004，22(5)：381-382【3】李辉霞，王德志，杨朋，乙肝两对半定量检测及临床意义，医学信息杂志2010，2
11、3（9）。【4】 Weber B, Dengler T, Berger A .Evaluation of two new autom ated assays for hepatitis B virus surface HBsAg detection IMMUIITE HBsAg_and IMMUlITE 2000 HBsAg J J .Clin Microbiol,2003 ,41,(1 )；13 5143 【5】郑怀竞临床免疫学检验质量保证M北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1995，99【6】王朝阳，段文强 ,乙肝两对半阴阳性之临床意义，中国社区医师杂志，2007，26(1)
12、：12-13. 10致 谢在论文完成之际，我首先向关心帮助和指导我的指导老师表示衷心的感谢并致以崇高的敬意！在学校的学习生活即将结束，面对现在的收获，我感到无限欣慰。为此，我向热心帮助过我的所有老师和同学表示由衷的感谢!在论文工作中，遇到了许许多多这样那样的问题，有的是专业上的问题，有的是论文格式上的问题，一直得到老师的亲切关怀和悉心指导，使我的论文可以又快又好的完成，老师以其渊博的学识、严谨的治学态度、求实的工作作风和他敏捷的思维给我留下了深刻的印象，我将终生难忘我的老师对我的亲切关怀和悉心指导，再一次向他表示衷心的感谢，感谢他为学生营造的浓郁学术氛围，以及学习、生活上的无私帮助! 值此论文
13、完成之际，谨向老师致以最崇高的谢意!最后，衷心地感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授!11附 录乙肝表面抗原是乙肝两对半的其中一项，乙肝两对半定性检测对乙肝疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用。但随着临床医学的发展，乙肝两对半定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求，特别是在疗效观察以及乙肝疫苗注射后抗体产生情况的观察上有明显的不足。随着检验医学的发展，乙肝两对半定量测定成为可行，大大弥补了乙肝两对半定性检测的不足。而且乙肝两对半定量检测可与HBV DNA荧光测定相互补充，综合评价患者病情与药物疗效，为低含量的慢性乙肝、病毒携带者提供了正确判断病情的依据【2】。这在目前的临床治疗中应用十分广泛。
