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1、血管新生与干细胞移植在下肢缺血中的应用,第一部分，干细胞研究和应用的基础知识,概念,干细胞(stem cell)是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能分化出至少一种高度分化子代细胞的细胞。 根据细胞来源将干细胞分成胚胎性干细胞和成体干细胞，而成体干细胞包括自体干细胞和异体干细胞。,干细胞移植的类型（1）,1、根据其分化潜能的宽窄将干细胞分类：（1）全能干细胞 (totipotent stem cells)，（2）三胚层多能干细胞(pluripotent stem cells)，（3）单胚层多能干细胞(multipotent stem cells)和 单能干细胞(monopotent stem
2、 cells)。,干细胞移植的类型（2）,（1）全能干细胞 (totipotent stem cells)：哺乳动物的生命周期始于受精卵，受精卵具有分化成体内200多种不同细胞类型的潜能，并能发育成为一个完整个体，细胞的这种潜能称为全能性，相应地，具有这种潜能的细胞则称为全能干细胞。 （2）多胚层多能干细胞：内细胞团细胞虽然失去了发育成完整个体的能力，但仍具有分化成个体中包括生殖细胞在内的各种细胞的潜能，具有这种潜能的细胞称为多胚层多能干细胞,干细胞移植的类型（3）,（3）单胚层多能干细胞：其分化潜能较前两者要窄许多，它只能分化成几种特定类型的细胞，如间充质干细胞通常只能分化形成骨、肌肉、软骨
3、、脂肪及其他结缔组织。却不能分化为除此以外的其他组织。 （4）单能干细胞：有的干细胞只分化成单种细胞，如神经元干细胞只能分化成神经元，而不能分化为显形胶质或少突胶质，这种细胞称为单能干细胞。,干细胞移植的类型（4）,2、根据细胞来源将干细胞分成胚胎性干细胞和成体干细胞。（1）胚胎性干细胞：胚胎性干细胞通常是指源自囊胚内细胞团的ES细胞(embryonic stem cells)，但通常人们将从畸胎癌中分离出来的EC细胞和从早期胎儿原始生殖细胞中分离、筛选到的EC细胞也归为胚胎性干细胞。,干细胞移植的类型（5）,（2）成体干细胞：指那些组织或器官特异性干细胞，它们主要用于维持细胞功能的稳态，早先
4、人们认为在一些经常更新的组织，如血液、小肠黏膜、表皮等中才存在着干细胞，这些干细胞负责机体的更新与创伤的愈合，但近年来的研究结果表明一些曾认为成熟后不再进行分裂的组织，如脑、肝中也存在着干细胞。,成体干细胞来源,目前发现有干细胞存在的组织类型也越来越广泛，这些组织包括：骨髓、外周血、脑、血管、骨骼肌、肝、胰、皮肤和胃肠道的上皮及脂肪等。其来源 有2种说法： A、一种是成体干细胞是在个体发育过程中残留下来的胚胎干细胞； B、另一种是成体干细胞是成体细胞在某些情况下(如外伤等)经过重新编程(reprogmmming)后形成的，甚至是细胞间自发融合的结果。究竟哪种说法是正确的？还有待于进一步的研究证
5、明。,人们的选择,目前由于各国对胚胎干细胞的伦理道德的争论，限制了胚胎干细胞的基础研究和临床应用前景，因此研究比较多的是成体干细胞。异体干细胞的免役排斥问题无法得到解决，而自体干细胞移植是采用患者自身的干细胞。,自体干细胞移植有2个优点,1、不存在异体干细胞的免役排斥；2、没有胚胎干细胞的伦理道德问题。此外，还具有取材方便的特点。因此，目前自体干细胞移植治疗疾病呈现出广阔的应用前景。,血管新生的类型,血管新生（neovasculogenesis）： 1、血管生成（angiogenesis） 2、动脉生成(arteriogenesis) 3、血管形成血管发生(vasculogenesis),血管
6、生成（1）,指源于毛细血管后微静脉，以“出芽”方式新生毛细血管。 在成体，主要由组织缺氧诱导低氧诱生因子（HIF）-1表达，再由后者活化包括血管内皮生长因子（VEGF）、VEGF受体1（flt-1）和血管生成素-2等诸多基因的转录而来。,血管生成（2）,在健康个体，血管生成主要局限于以下四种情况：月经周期中的子宫内膜生成；妊娠期时的胎盘形成；急性创伤后的伤口肉芽生长；毛发生长初期的毛囊血管化。,动脉生成,指血管造影可以鉴别的足够管径的侧枝循环的成熟或新生。 它通常发生在局部缺血组织之外，与动脉狭窄局部剪切应力变化导致的血液中单个核细胞的聚集有关。 目前对其认识尚不深刻，似乎与一系列生长因子包括
7、成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、VEGF和CXC细胞因子的释放有关。,血管形成（1）,则是指由循环血管内皮祖细胞（EPCs）和血管前体细胞在原位形成新生血管的过程。传统认为血管形成只局限于胚胎发育时期，直到1997年，Asahara等发现纯化的CD34+造血干细胞能在体外分化为有内皮细胞表型的细胞并将其称之为EPCs，这一“认识”才被翻转。,血管形成（2）,随着研究的深入，发现外周血中的EPCs有不同的来源：造血干细胞中的部分细胞；内皮细胞培养环境中的髓样细胞（CD14+/CD34-）；其他循环中的前体细胞；外周循环中成熟的内皮细胞。,根据这一异源群体的增殖特性和
8、在血管新生中的作用将其分为：,早期EPCs，即来源于髓样细胞（单核-巨噬细胞系，CD14+）的循环成血管前体细胞，在血管新生中主要通过分泌生长趋化因子如VEGF、白介素-8（IL-8）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）发挥作用。 晚期EPCs,类同于前述的骨髓来源的循环内皮祖细胞，亦称outgrowth endothelial cells（OEC），具有强大的增殖潜能，通过直接参与血管新生并分泌MMP-2发挥作用。 循环内皮细胞（circulating endothelial cells,CECs）,被认为是由血管内皮脱落的细胞，具有不同的增殖潜能。,干细胞时代的到来,1997-1998年间不
9、少研究者发表了利用成人骨髓中和外周血内CD34+细胞体外培养扩增出表达内皮标记的细胞，而且发现这些细胞能够掺入到缺血组织部位的新生血管中的研究报告。这些研究结果开启了应用“干细胞”移植促进血管新生，治疗血管闭塞症的时代。,目前的观点,当组织因血管闭塞等原因发生缺血缺氧时，会上释放一系列细胞因子，促进EPC脱离与骨髓基质的联系，释放到外周血中。临床应用G-CSF或也能达到上述动员目的。,这些被动员出的和外周循环中已存在的一些列与血管新生有关的细胞在细胞因子的趋化作用下向血管损伤部位移行，归巢（home）到损伤部位，在细胞因子的作用下，发生增殖分化，修复损伤的血管内皮或形成新生血管。,不同细胞成份
10、的功能也不同,1、源于骨髓的早期EPC在血管新生中可能起到初始的作用；2、循环内皮细胞（CECs）在外周血中的数量与血管损伤的严重程度相关，因此可作为预示疾病程度的生物指标；3、EOCs细胞通过其较强的增殖分化潜力修复损伤或新生血管；源于单核/巨噬细胞分化而来的内皮细胞具有较强的细胞因子生长因子分泌功能，促进血管新生细胞因子促进血管新生。,问题出现,上述研究成果为临床工作提示新的研究方向，究竟骨髓或外周血中的细胞中那些细胞成分对血管新生有更多的益处？ 1、他们的适宜数量是多少？ 2、哪些细胞组合能够最限度地发挥干细胞促进血管新生的作用？ 3、哪些混杂细胞则可能无效或有抑制作用？研究这些细胞成分
11、和数量的有效搭配可能达到有效提高治疗疗效和效率的目的。这也是干细胞研究的热点之一。,细胞因子的作用,在新生血管形成的过程中许多细胞因子如VEGF、SDF、PDGF和 hepatocyte growth factor起这非常关键的促进作用 。 细胞因子的副作用比较大：基因重组VEGF已开始I期临床应用，证明有一定改善缺血部位血流灌注效果，但全身应用VEGF可引起高血压，浮肿等副作用。将携带有VEGF基因编码的质粒直接注射到缺血部位肌肉中，可达到短时间表达并改善缺血部位血流灌注及缓解临床症状的效果。-这可能是条光明大道？,细胞因子的作用,尽管目前对调控血管新生的细胞因子有了一定的了解，但仍非常局限
12、。实际上血管新生是极其复杂的和多因素影响的过程，可以想象出在血管新生过程中，众多的细胞因子是在不同的阶段以不同的浓度和不同的组合发挥着精确的调控作用。,干细胞应用的意义,目前研究发现：在高龄、糖尿病和动脉粥样硬化等病理状态下，EPCs的数量、对Stromal-derived factor-1 (SDF-1)反应性降低，EPCs特异分子如Flk-1, Flt-1, CD133和VE-cadherin的mRNA水平明显低于健康对照。这说明此类病人自发的血管新生潜能的降低，也为自体骨髓干细胞移植提供了一定的理论依据。,治疗性血管形成,1999年，Isner等提出了“治疗性血管形成”（therapeu
13、tic vasculogenesis）的概念，倡导补充EPC数量来增加血管生长因子的作用底物，达到更好的血管新生效果，治疗缺血性疾病。这可以说是一个生理加强疗法。,相关临床治疗观察发现：尽管部分患者可获得较好的疗效，但仍有许多患者并未从治疗中获益；因此进一步寻找能够提示预后的临床和生物学指标对这项治疗的开展也有十分重要的意义。,研究的意义,患者年龄，原发病的类型、病程、临床分期，糖尿病的胰岛素抵抗等临床指标和患者外周血中循环的EPC、CECs含量，细胞因子动员的效果等与预后的关系都尚未被明确； 目前还发现许多细胞因子在不同患者和不同病患部位局部的含量存在极大的差异，因此进一步研究这些问题，不仅
14、可能用以预测治疗效果，也可能提示治疗的个体化方案。,目前国内外的最新进展促使我们对“骨髓干细胞”移植血管新生的作用机理、机体内环境对干细胞疗效的影响以及转基因骨髓源干细胞的作用进行进一步的研究，以提高干细胞的治疗效果。 我们在临床和动物实验中均发现：骨髓干细胞治疗肢体动脉缺血的疗效差异与植入细胞数量、类型、细胞存活效率以及病变区域的微环境有关。,干细胞移植促进血管新生治疗下肢缺血的研究 （1）,与血管新生相关的干/祖细胞的定义和功能：临床上的治疗过程中主要采集骨髓或外周血来源的单个核细胞进行移植，并认为其中的CD34+或CD133+/VEGF-R2+细胞为血管新生的干/祖细胞，但这类细胞的增殖
15、分化功能、他们的归巢到血管损伤部位的能力以及达到治疗效果的有效数量等都是尚未充分了解的内容。,干细胞移植促进血管新生治疗下肢缺血的研究 （2）,与血管新生相关的细胞因子的功能和协调作用：目前已发现并初步应用于临床的细胞因子包括VEGF、SDF、PDGF和 肝细胞生长因子（HGF）等，但他们在临床治疗中的有效剂量、途径和相互协调或拮抗作用、以及应用在不同基础病患者的效果是否相同等等都是尚未解决的问题。,干细胞移植促进血管新生治疗下肢缺血的研究 （3）,不同基础病患者的机体内环境对干细胞移植治疗下肢缺血的影响因素：目前干细胞移植治疗下肢缺血的I、II期临床观察主要研究这种治疗的安全性和初步的有效性
16、,但针对不同基础病患,不同年龄、不同血管病理改变以及由此可能导致的体内不同细胞因子浓度变化等等多因素对治疗效果的影响尚未有深入的了解。,第二部分，干细胞移植的临床应用,一、自体骨髓干细胞临床研究内容,1、缺血局部肌肉注射与血管腔内注射疗效的对比性研究-结果：2组无统计学差异。 2、上述的治疗效果是不是干细胞的作用？-2种不同移植浓度移植后的对比性研究-单条下肢单个核细胞总数108时，大多数患者有效果；细胞总数105时，无效。 3、自体骨髓干细胞血管腔内移植治疗严重下肢缺血对比研究-2组无明显差异。 4、下肢缺血的不同时期对疗效的影响？-早期效果明显优于晚期。 5、骨髓干细胞移植与外周血干细胞移植治疗下肢缺血的对比性研究。 6、动员后骨髓干细胞移植治疗下肢缺血的临床研究。 7、外周血干细胞移植治疗下肢缺血的临床研究。 8、自体干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的中期疗效观察。,干细胞的类型,1、从细胞分化潜能的宽窄不同分类：（1）全能干细胞 ，（2）三胚层多能干细胞，（3）单胚层多能干细胞和单能干细胞。 2、从细胞的来源不同分类：（1）胚胎性干细胞（2）成体干细胞,
