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1、第十六章 高效液相色谱法 一、高效液相色谱法的特点 二、流程及主要部件 三、影响分离的因素 四、高效液相色谱法的主要分离类型,概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。,一、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。,被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换
2、作用或分子尺寸大小的差异进行分离。 色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。,根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。,它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：,高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法
3、快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cmmin-1。,高效液相色谱法与经典液相色谱法,例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。 对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。 又如用25cm 0.46 cm 的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。,（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20。对于
4、占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。,高效液相色谱法与气相色谱法,（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。,液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。,
5、（3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。,目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。,高效液相色谱仪的结构示意见图20-1，一般可分为4个
6、主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。,高效液相色谱仪,其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,高效液相色谱仪1,高效液相色谱仪2,高效液相色谱仪3,高效液相色谱仪4,一、高效液相色谱法的特点,1.流程,二、流程及主要部件,2. 主要部件： （1）高压输液泵： 主要部件之一，压力：150350105 Pa 应具有压力平
7、稳、脉冲小、流量稳定可调、 耐腐蚀等特性。,由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。,对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。,恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。 目前恒流泵正逐
8、渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。,高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。 柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。,（2）进样系统,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：,进样装置,色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料的其他金属。玻璃管耐
9、压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。,（3）分离系统色谱柱,一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。,柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。,柱体为直型不锈钢管，发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,高效分离柱,作用 用来连续监测经色谱
10、柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。,（4）检测系统,另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 现将常用的检测器介绍如下:,目前最常用的检测器主要有：,1.紫外-可见检测器,紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9gmL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。,2.荧光检测器 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。
11、 特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高23个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。,荧光检测器结构示意图,3.蒸发光散射检测器,蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。,4.电化学检测器（以电导检测器为例）,问题 电导检测器怎样消除流动相电导的干扰？ 例如，采用阳离子交换色谱分离碱金属离子时，通常用HCl作为流动相。,5.示差折光率检测器 几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7gcm-3。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。,(5)附属系统 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动
12、进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。,梯度洗脱装置 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。,梯度洗脱装置分为两类： 一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。,梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，
13、使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温。所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。,在线脱气装置 在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。 除在线脱气装置外，目前也采用超声脱气、真空脱气等方式。,脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘移，噪音增加。,在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：,影响分离的主
14、要因素有流动相的流量、性质和极性。,三、影响分离的因素,流速：流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。,影响分离的因素,固定相及分离柱：气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。,高效液相色谱的固定相和流动相,（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O1081.O109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙
15、度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。,硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。,1.表面多孔型固定相,它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。 表面活性材料为氧化铝的固定相，这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允
16、许量受限制。,2全多孔型固定相,它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相， 这类固定相由于颗粒很细（510m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。,流动相及流动相的极性,（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。 （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。,（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,流动相组成,流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂: 烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,
