分子生物学操作基本技术

《分子生物学操作基本技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学操作基本技术（101页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、质粒操作（提取、酶切、电泳） 细菌DNA提取 细菌间基因重组,讲课内容：,一、细菌核酸的基本知识,1、染色体,主要遗传成分，携带基本代谢的全部基因，呈共价闭合环状 (Covalently Closed Circle，简称CCC) ，一般只有一条，在细 胞中以紧密缠绕成的较致密的拟核(nucliod)，其上结合有类 组蛋白蛋白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚 架形的致密结构。,染色体上编码各种功能的基因比例,%,2、质粒,一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子。,通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；,质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在

2、10kb以内）,（1）宿主细胞染色体DNA分子量明显大于细胞所含质粒DNA分子量，如大肠杆菌（Escherichia coli）染色体的DNA分子为4.6103kb左右，而通常用于基因工程中的载体一般均小于10kb，1100106Da。 （2）质粒所携带的遗传信息量较少。携带的遗传信息所一般只与宿主细胞的某些次要特性有关，而并不关系到细胞的生死存亡。,微生物质粒DNA与染色体DNA差别在于：,质粒具有下列特性：, 可转移性。即某些质粒可以细胞间的接合作用或其它途径从供体细胞向受体细胞转移。, 可整合性。在某种特定条件下，质粒DNA可以可逆性地整合到宿主细胞染色体上，并可以重新脱离。,可消除性。

3、经某些理化因素处理如加热、或加入丫啶橙或丝裂霉素C、溴化乙锭等，质粒可以被消除。,质粒的相容性：不同质粒在同一宿主细胞内的共存性。,有一个复制起始点，能自主复制； 具有明显的筛选标记，如： （1）Ampr 水解内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素失活。 有克隆位点（MCS 外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量尽量小，以容纳较大的外源DNA。,基因工程质粒载体的特点,本来不

4、能在含青霉素的平板上生长的受体菌在转化子（含有 Ampr质粒）周围形成卫星菌落（b-内酰胺酶分泌到胞外所致）,克隆载体：pUC18/19,注意： 蓝白斑需要诱导,启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。 纯化标签His-tag和S-tag 凝血酶切点 蓝白斑筛选需要诱导,广宿主载体pBBRMCS系列,复制起始位点通用 Mob负责接合转移 蓝白斑无须诱导,自杀性载体pSC123,复制起始位点需要特殊蛋白结合 TraJ负责接合转移 Mariner负责跳跃,pBK-CMV：原核、真核双元表达载体,反向筛选标记,Nucleic Acid Research ,2006 , IF :7.552,二、针对

5、质粒和总DNA的操作,质粒的提取 总DNA的提取 质粒或DNA片段的酶切 酶连 电泳 酶切产物的回收,1. 质粒的提取,溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0。,1 挑取转化筛

6、选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37震荡培养1216小时； 2 将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec，弃上清液，在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮 3 加入100L预冷的溶液I ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散； 溶液I中的葡萄糖的作用是增大粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2）结合，降低DNase对DNA的降解。 4 加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置35min; 溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使

7、DNA变性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构,5 加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置23min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性 6 12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中 7 加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放置2min. 8 12000g离心10min，弃上清液，再用70的乙醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在真空浓缩系统上干燥质粒； 9 加入40L含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解

8、提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)，存于20或直接用于酶切。,细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸,2. 总DNA的提取,基本原理和过程：,机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。,细胞破碎,SDS：SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。,DNA和蛋白的分离,蛋白质：常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1

9、） RNA：常选用RNase消化 多糖：提取液中加1PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 。,DNA纯化（去杂质）,1）-70冰箱划出保存菌种，30 LBM培养基培养过夜； 2）选取分隔良好的单菌落，接种到200mlLB液体培养基中，30，震荡培养过夜； 3）4，4000rpm，10min回收菌体，用20ml 0.85%NaCl，洗涤两到三次； 4）去除上清液，用TE缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，室温反应30min； 5）加入10%SDS，至终浓度1%，50，10min； 6）加入20mg/ml的蛋白酶K，至终浓度100g/ml，温和颠倒离心管数次，37过夜反应或503hr。,7）加入5

10、M NaCl到终浓度0.7M，充分混匀，然后加入1/10体积的CTAB/NaCl，混匀，65，20min； 8）冷却到室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，8000rpm,10min，4离心，回收水相； 9）重复抽提溶液，直至没有白色界面出现，上清加入1/10体积的3M NaAc（pH7.0），0.6倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀； 10）用顶端封闭的L型毛细管勾出丝状DNA沉淀，转入70%乙醇中漂洗，晾干片刻，（不可完全干透，否则极其难溶解），于3-5ml的TE中轻轻搅动，使其脱落，4放置过夜，使完全溶解。,RNase可在step6 加入,Total DNA extraction,限制性核酸内切

11、酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,3. 限制性内切酶,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,限制性核酸内切酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,质粒或DNA片段的酶切过程： 1、在0.5mL Ep管中依次加入

12、下列溶液于0.5ml离心管中 提取质粒DNA 3.0 L 10 buffer H 1.0 l EcoR I 2.0 U dd H2O 5.8 L 10 L 2、 轻轻混匀, 置于37水浴中酶解1.5h。,保护碱基：PCR产物末端限制酶切位点的切断情况,各种内切酶在不同通用缓冲液中的活性,双酶切时通用缓冲液中的选择和方法,相邻酶切位点的双酶切效果,相邻酶切位点分步酶切时的效果,双酶切电泳检测,M. Marker; 1PCR product ; 2. pET29a/KpnI6. pET29a,4、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 (密度与琼脂糖浓度相关

13、)；生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时，它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快。,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应，正极发生

14、的是氧化反应（4OH-4e-2H2O +O2)，负极发生的是还原反应（4H+4e-2H2)，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，是溶液两极的pH保持基本不变。 电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。 电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。,Tris-硼酸（TBE

15、） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE）,常用电泳缓冲液,TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量，且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。 TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。 TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇

16、沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： 增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 使样品呈色，使加样操作更方便。 形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。,上样缓冲液,溴化乙锭（EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。,核酸染色剂,注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。,DNA分子量标

17、准,1.凝胶制备：制备0.8%琼脂糖凝胶。称取0.8g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100mL 1TAE缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。将梳子放置在制胶槽上，在冷却至60左右的琼脂糖凝胶液加入一小滴EB，小心混匀，倒到制胶槽上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，不要产生气泡（厚度约为34mm）；室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子。制好胶后将凝胶连同内槽放在含有1TAE缓冲液的电泳槽中使用(注意:电泳槽中的缓冲液应与配胶用的缓冲液成分、浓度一致)。 2.加样和电泳：用微量加样器将样品分别加入胶板的样品孔内加完样后的凝胶板即可通电进行电泳（切记靠近加样孔的一端为负， 80100V的电压下电泳，一般情况下，电压/电极间距离应小于5V/cm），当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳。 3.观察拍照,