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1、色谱条件的选择讲稿 山东大学 王吉顺 2005.8,色谱条件包括以下内容： 1.仪 器：生产商，型号 2.色谱柱：柱商品名称，填料商品名称，填料类型， 色谱 柱长度（cm）和内径（mm），填料粒经（um） 3.流动相：流动相组成和比例，流速（ml/min） 4.检测器：型号及参数（如波长nm） 5.进样量：体积（ul） 6.柱 温：（） 其中我们更为关心的是：色谱柱和流动相（本章节主要讨论的问题）,色谱柱的选择,大多数化合物是可以使用C18柱分离 C18优点：柱便宜，流动相便宜，使用时间长，易于通过改变流动相得到最佳分离， 药品本身具有纯度高的特点，容易分离，辅料和分解产物是分离的难点。 比中
2、药成分的分离，体液中药物成分的分离，微量成分的分离，杂质成分的分离，食品中药物残留的分离简单的多。,选择色谱条件的方法,1查文献，学习别人的方法 2文献中没有的新药和新化合物可以使用结构类似化合物的色谱条件 3自己积累药物分析的色谱条件，从中寻找规律，尤其是要总结解决问题的方法。把自己积累的方法用于以后的色谱分析中。 不建议在自己对被分离物质的性质不了解的情况下，自己摸索色谱条件,色谱柱的分类,1 根据担体材料分类 （1）硅胶型：SiO2；C18；C1三甲基；C2；C4；C8；CN；NH2；苯基 （2）聚合物型： 聚苯乙烯类（离子交换；凝胶色谱柱）； 聚丙烯酸酯（离子交换）； 聚乙烯醇：C18
3、；离子交换 （3）钛柱：比硅胶型的稳定性提高 （4）其它类型,色谱柱的分类,2. 根据分离方式分类 (1)正相：SiO2； CN；NH2；苯基 (2)反相：C18；C1三甲基；C2；C4；C8；CN；NH2 ；苯基 (3)离子交换：弱碱阴离子交换；弱酸阳离子交换 强碱阴离子交换；强酸阳离子交换 (4)凝胶过滤：水溶性凝胶过滤；油溶性凝胶过滤 (5)其它类型：手性柱等,色谱柱的分类,3.根据色谱柱尺寸分类 （1）10cm50cm内径为制备柱 （2）4cm8cm内径为标准柱 （3）3cm一下内径为小孔柱或微孔柱和毛细管柱 （4）柱长一般为15cm、25cm、30cm；50cm一般用于制备柱或特殊柱
4、型，5cm一下为快速柱(包括预柱和保护柱),色谱柱选择方法,1.氨基酸 (1)结构特殊，一般使用离子交换柱分离，阳离子交换柱是使用最广泛,是最成熟的方法。分离氨基酸的阳离子柱分为锂型柱和钠型柱，锂型柱可以分离谷氨酰胺和谷氨酸。 (2)反相柱也可以分离氨基酸，但不能分离所有氨基酸。柱前衍生化法分离水解氨基酸也非常有效，且方法简便，所用的仪器简单。,氨基酸分析,分析条件： 色谱柱：Shim-pak ISC-07/S1504Li（15cm 4.0mm） （Li型磺酸基，氨基酸分析专用柱） 流动相：柠檬酸缓冲溶液，梯度洗脱 流速：0.3ml/min 柱温：55 检测器：荧光（Ex.238nm,Em45
5、0nm） 方法：OPA柱后衍生化法,色谱柱选择方法,肽和蛋白质 凝胶过滤：根据分子量的大小差别进行分离 离子交换：根据分子所带的电荷的差别进行分离 反相和疏水色谱：根据分子的疏水性质的差别进行分离 亲和色谱：根据复合的相互作用的差别进行分离,蛋白质,分析条件： 色谱柱：Shim-pak Diol300 （50cm 7.9mm） （二醇基水溶性凝胶柱， 蛋白质分析专用柱） 流动相：10mM磷酸缓冲液（ pH7 ） 和0.1MNaCl 流速：1.0ml/min 柱温：室温 检测器：紫外（280nm） 色谱峰：1.谷氨酸脱氢酶 2.乳酸脱氢酶 3.烯醇酶 4.腺苷酸激酶 5.细胞色素C,蛋白质,分析
6、条件： 色谱柱：Shim-pak Diol300 （50cm 7.9mm） （消除残留硅醇基C2柱， 300A多孔硅胶） 流动相：硫酸铵/磷酸缓冲液（ pH7 ） 梯度洗脱 流速：0.5ml/min 柱温：室温 检测器：紫外（220nm） 色谱峰：1.细胞色素C 2.肌红蛋白 3.核糖核酸酶A 4.铁传递蛋白 5.糜蛋白酶原A,色谱柱选择方法,核酸 核酸在生命科学领域中占有重要位置，在今后的新药研发领域中同样占有重要位置。核酸可以分为一下三类： 腺嘌呤（核酸碱基） 腺苷（核苷；核酸碱基糖） 腺苷酸（核苷酸；核苷磷酸） 腺嘌呤（核酸碱基）和腺苷（核苷；核酸碱基糖）用阳离子交换柱或反相柱进行分离；
7、 腺苷酸（核苷酸；核苷磷酸）用阴离子交换柱分离，选择合适的流动相也可以用反相柱进行洗脱；,核酸,分析条件： 色谱柱：Shim-pak WAX1 （5cm 4.0mm） （叔氨基阴离子交换柱， 用于分析核苷酸） 流动相：20mM磷酸缓冲液（ pH7 ） 480mM磷酸缓冲液（ pH6.8 ） 梯度洗脱 流速：1.0ml/min 柱温：45 检测器：紫外（260nm） 色谱峰：1.尿苷酸 2.胞苷酸 3.腺苷酸 4.鸟苷酸 5.尿苷二磷酸 6.胞苷二磷酸 7.腺苷二磷酸 8.尿苷三磷酸 9.鸟苷二磷酸 10.胞苷三磷酸 11.腺苷三磷酸 12.鸟苷三磷酸,核酸,分析条件： 色谱柱：Shim-pak
8、 SBCC8 （15cm 2.5mm） （小孔径硅胶键合C8） 流动相：20mM磷酸二氢钾缓冲液/甲醇（93/7） 流速：0.5ml/min 柱温：室温 检测器：紫外（260nm） 色谱峰：1. 胞苷 2.尿苷 3.鸟苷 4.胸苷 5.腺苷,核酸,分析条件： 色谱柱：ODS柱 （15cm 6.0mm） （经甲烷基化处理的ODS柱） 流动相：100mM磷酸缓冲液和 200mM高氯酸钠溶液 梯度洗脱 流速：1.5ml/min 柱温：50 检测器：紫外（260nm） 色谱峰：1.未知峰 2.胞嘧啶 3.尿嘧啶 4.鸟嘌呤 5.腺嘌呤 6.胞苷 7.尿苷 8.胸腺激素 9.腺苷 10.鸟苷 11.胸苷
9、,色谱柱选择方法,糖的分离 糖的种类很多，可分为单糖（木糖，阿拉伯糖；葡萄糖，果糖，半乳糖）、二糖（蔗糖，麦芽糖）、低聚糖和多糖。 单糖和二糖可以使用氨基柱分离（分离异构体效果不很好），还可以使用阴离子交换柱分离，缺点是分离时间较长。 低聚糖也可以使用氨基柱分离（分离异构体效果不很好），还可以使用水溶性凝胶过滤色谱柱进行分离（色谱柱价格较贵，色谱柱不易保存）。 多糖使用水溶性凝胶过滤色谱柱进行分离。 另外还用部分公司生产糖分析专用色谱柱。,糖的分离,分析条件： 色谱柱：NH2柱 （15cm 6.0mm） （硅胶键合 NH2柱） 流动相：乙腈/水（7/3） 流速：1.0ml/min 柱温：室温
10、检测器：示差折光 色谱峰：1.丙三醇 2.木糖 3.果糖 4.葡萄糖 5. 蔗糖 6.麦芽糖 7.乳糖,糖的分离,分析条件： 色谱柱：磺化聚苯乙烯Ca型柱 （30cm 7.9mm） （分离机理为凝胶渗透配位交换） 流动相：乙腈/水（7/3） 流速：1.0ml/min 柱温：室温 检测器：示差折光 色谱峰：1.丙三醇 2.木糖 3.果糖 4.葡萄糖 5. 蔗糖 6.麦芽糖 7.乳糖,色谱柱选择方法,维生素的分离 维生素分为水溶性维生素和脂溶性维生素 水溶性维生素： 维生素B，维生素C，维生素H，维生素P，泛酸等 脂溶性维生素： 维生素A，维生素D，维生素E，维生素K 分离方式： 和脂溶性维生素均
11、可使用反相洗脱法分离。 一些脂溶性维生素可以使用分配色谱法分离,维生素C的分离,分析条件： 色谱柱：NH2柱 （15cm 6.0mm） （硅胶键合 NH2柱，分配色谱） 流动相：乙腈/10mM磷酸缓冲液（pH2.6）（3/1） 流速：1.5ml/min 柱温：40 检测器：紫外（245nm） 色谱峰：1.异抗坏血酸 2.抗坏血酸,维生素E的分离,分析条件： 色谱柱：SiO2柱 （5cm 4.6mm） （硅胶键合 NH2柱，分配色谱） 流动相：正己烷/二恶烷/乙醇（98/2/0.2） 流速：2.5ml/min 柱温：室温 检测器：紫外（295nm） 色谱峰：,维生素E的分离,分析条件： 色谱柱：
12、NH2柱 （15cm 6.0mm） （硅胶键合 NH2柱，分配色谱） 流动相：正己烷/异丙醇（25/1） 流速：1.5ml/min 柱温：40 检测器：紫外（297nm） 色谱峰：,维生素B族的分离,分析条件： 色谱柱：ODS柱 （15cm 6.0mm） （硅胶键合 NH2柱，分配色谱） 流动相：【100mM硫酸钠（pH2.1）和1.2mM辛烷磺酸钠】/乙腈（9/1） 流速：1.2ml/min 柱温：40 检测器：紫外（210nm） 色谱峰：1.烟酸 2.烟酰胺 3.泛酸 4.磷酸核黄素 5. 吡哆素 6.咖啡因 7.硫胺素 8.核黄素,色谱柱选择方法,阴阳离子分离 阴离子可以使用离子交换柱分
13、离，也可以使用C18分离（离子对色谱法）。,离子交换法分离二价阳离子,分析条件： 色谱柱：磺化聚苯乙烯磺酸基离子交换柱 （15cm 5.0mm） （离子交换色谱） 流动相：0.3M乳酸水溶液 流速：1.0ml/min 柱温：40 检测器：电导 色谱峰：,离子对色谱法分离阴离子,分析条件： 色谱柱：ODS柱 （15cm 6.0mm） （硅胶键合 NH2柱，分配色谱） 流动相：0.8mM苯三酸和10mM四丁基氢氧化铵 （pH4.6） 流速：1.5ml/min 柱温：40 检测器：紫外（282nm） 色谱峰：,色谱柱选择方法,非极性化合物和弱极性化合物 一般使用ODS均可分离。 被测样品在流动相中微
14、溶，如果溶解度大则出峰较快，不溶则不出峰。 芳烃一般作为ODS柱的柱效测试样品，以甲醇水作流动相便可得到对称峰型，否则色谱柱有问题。 如果非极性化合物和弱极性化合物在ODS上拖尾，四氢呋喃是很好的减尾剂。 带有氨基的有机化合物是检验ODS柱是否封端的指示剂（如尿嘧啶）。,色谱柱柱效测定方法,分析条件： 色谱柱：ODS柱 （15cm 6.0mm） 流动相：甲醇/水（3/1） 流速：1.0ml/min 柱温：40 检测器：紫外（254nm） 色谱峰：1.尿嘧啶 2.苯 3.萘 4.联苯,色谱柱选择方法总结,1查文献，学习别人的方法 2文献中没有的新药和新化合物可以使用结构类似化合物的色谱条件 3自己积累药物分析的色谱条件，从中寻找规律，尤其是要总结解决问题的方法。把自己积累的方法用于以后的色谱分析中。 不建议在自己对被分离物质的性质不了解的情况下，自己摸索色谱条件,
