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1、第十四章 附肢的发育和再生,概述,附肢发育的研究是发育生物学的一个重要课题。脊椎动物，特别是鸟类和两栖类附肢（limb）的发育包含了大量的、各种各样的诱导作用。 有尾类的蝾螈和美西螈附肢具有明显的再生能力，是研究再生的极好模型。,第一节 脊椎动物附肢的发育,脊椎动物的附肢是一个极其复杂的器官，每一块骨和肌肉的位置都被精密地组织在一起。 附肢在三个基本轴上是不对称的，但左前肢总是和右前肢呈镜面对称。 脊椎动物的附肢都是由体壁中胚层和外部表皮共同组成。,鸡翅内骨的排列模式及其不对称性,孵化10天的完整鸡翅标本,示三个发育轴：近侧-远侧轴、前后轴及背腹轴。,前部的,后部的,近侧的,远侧的,背侧的,腹
2、侧的,在所有的四足动物中，附肢发育的基本形态发生原则是相同的。 构建一个附肢所需要的位置信息要在一个三维（或包括时间在内的四维）的、相互协调的系统中发挥作用。现在已鉴定了一系列蛋白，在附肢近远轴、前后轴和背腹轴的形成过程中发挥作用。,一、附肢的起源,脊椎动物的附肢在起源上是由胚胎体壁向外生长形成的，主要是由来自中胚层的疏松间质形成的中央核，以及来自外胚层的表皮两大部分组成。 附肢的原基称为附肢芽（limb bud）。 附肢芽形成的位置在每一物种是恒定的，由Hox基因沿身体前后轴表达的水平决定。,鸡胚胎的肢芽,孵化后第三天胚胎的侧面出现肢芽。,翅肢芽,腿肢芽,顶外胚层嵴,体节,附肢域,能形成一个
3、附肢的所有细胞，称为附肢域（limb field）或附肢场。 附肢域包括位于中央的、产生附肢本身的中胚层细胞（附肢盘，limb disc）以及形成周围的躯干组织和肩带/腰带细胞。 附肢域起初具有调节失去或增加部分附肢的能力，附肢域中的每个细胞都能被指令形成附肢的任意一部分-调和等能系统。,美西螈（Ambystoma maculatum）的预定前肢场,视黄酸RA对于肢芽的向外生长具有重要的意义。用药物阻断RA的合成，将抑制肢芽最初的形成。,A，RA处理蝌蚪的尾巴引起肢的再生； C，RA处理促进肢芽的形成（箭头所指部位）。,二、附肢的早期发育,附肢早期发育的第一个迹象： 预定形成附肢的细胞从附肢域
4、侧板中胚层（附肢骨骼的前体）和体节中胚层（附肢肌肉的前体）分离出来，转变成一团间质细胞，这些间质细胞向侧面迁移到侧板中胚层和表皮之间，牢固地贴附于表皮内表面。,两栖类胚胎中附肢由中胚层起源的图解,肢芽,肢芽,覆盖在间质细胞团表面的表皮变得稍微增厚，同时被包裹在内部的间质细胞团向外突出，形成肢芽（limb bud）。,肢芽,中胚层细胞,成纤维细胞生长因子 FGF10,形成预定附肢间质细胞中的侧板中胚层细胞提供肢芽形成的信号，这些细胞分泌的FGF10能够启动上皮和中胚层细胞之间的相互作用。 含有FGF10的磁珠（bead）异位放置于上皮下方，会诱导出额外的肢芽。,FGF10的表达及其在鸡肢发育过程
5、中的作用,三、前肢和后肢的特化,Gain-of-function实验结果表明，转录因子TBX4和TBX5分别与后肢和前肢的特化有关。 Loss-of-function资料也表明，人类TBX5基因缺失会导致上肢和心脏的异常，但下肢基本不受影响。,TBX4 和TBX5在肢型特化中的作用,TBX4和TBX5在FGF10诱导形成的肢芽中的表达,异位表达TBX4，可以使FGF10诱导形成的前肢转变为后肢,四、顶外胚层嵴的形成,随着鸟类和哺乳类的中胚层间质细胞进入肢区，它们分泌的因子诱导肢芽顶端前、后边缘的外胚层细胞伸长，形成一个增厚的特殊结构，称为顶外胚层嵴（apical ectoderm ridge，
6、AER）。AER是一个临时的结构，对于附肢的继续向外生长是至关重要的。,间质细胞分泌的因子可能是FGF10，其他的FGF因子如FGF2、FGF4和FGF8虽然也可以诱导AER的形成，但FGF10合成的时间和位置都是适当的。FGF10能够诱导鸡胚背腹交界处的外胚层形成AER。在背部化的肢芽突变体中，由于没有背腹交界，便不能形成AER。,扫描电镜观察孵化4.5 天的鸡胚肢芽,显示顶外胚层嵴AER,背侧,腹侧,附肢发育中外胚层和中胚层间的相互作用,附肢的向外生长涉及AER和中胚层间持续的 相互作用。一旦中胚层诱导其上方的外胚层形成AER，AER与中胚层的相互作用对附肢的向外生长是最重要的。中胚层在附
7、肢发育中也起着关键的作用。AER起初的形成和继续存在依赖于位于其下方的中胚层。,AER与位于其下的中胚层的相互作用,在附肢发育期间任何时间除去AER，远端附肢的进一步发育停止。 当额外的AER移植到附肢芽上将形成超数附肢结构，通常朝向附肢远端。 将腿间质直接置于翅的AER下方，远端的后肢结构（趾）在附肢末端发育（然而，如果腿间质离AER较远，后肢间质进入翅的结构）。 当非附肢的中胚层移植到AER下方，则AER退化，附肢发育停止。,附肢发育中外胚层和中胚层间的相互作用,附肢发育中至少要求三种类型的外胚层和中胚层间的相互作用： 第一，中胚层起始附肢芽向外生长和形成AER； 第二，AER进一步刺激肢
8、芽的向外生长以及肢芽中胚层的增殖和分化； 第三，附肢芽中胚层提供保持AER所必须的刺激。,五、附肢发育时期轴的建立,脊椎动物完全形成的附肢包含三个轴的发育：近远轴（proximal-distal, P-D）、背腹轴（dorsal-ventral，D-V）和前后轴（anterior-posterior, A-P）。附肢发育中三个轴的建立具有各自的时间性，它们好像是按下列顺序决定的：前后轴、背腹轴和近远轴。,1.近远轴的发育,附肢沿近远轴的分化：由AER和附肢中胚层诱导的相互作用产生的。 附肢芽的逐渐向外生长： 由于位于AER下面间质细胞的增殖； AER释放的分子（成纤维细胞生长因子FGF）维持间
9、质细胞不断进行分裂。,由AER合成、释放到其下的间质中的成纤维细胞生长因子FGF可能是鸡胚中维持间质细胞增殖的分子。,AER和附肢芽中胚层的相互作用,外胚层嵴顶端对于肢芽近远轴图式的发育是必须的。从正在发育的肢芽中去除AER，将导致肢芽生长的停止；在发育后期将AER去除，可得到较为完整的肢。,生长因子可以替代顶外胚层嵴,将AER切除后，移植能释放生长因子FGF-8的玻璃珠，可使肢几乎正常发育。,背腹轴的分化 在鸡翅中，沿背腹轴有一很清晰的图式。背腹轴的组成部分是由早期鸡胚胎预定肢芽区域的外胚层决定，并在背腹轴之间发育形成顶外胚层嵴。 在突变小鼠中控制着脊椎动物肢的背腹轴的基因已经被确定。 Wn
10、t-7a基因在肢背部中胚层图示形成中起到关键作用。,2.背腹轴的分化,从体节发出的信号参与背部外胚层的确定。在鸡翅芽中，背腹外胚层界线的建立明显有来看Notch受体信号的参与。 含有homeobox的基因Engrailed-1在AER形成之前就已经在附肢腹部的外胚层特异地表达，有可能特化为将来的腹部区域。,外胚层控制发育中肢的背腹轴图式的形成。Wnt-7a在背部外胚层中表达，而Engrailed基因在腹部外胚层中表达。lmx-1基因在背中胚层中被Wnt-7a诱导表达，并且参与背部结构的确定。,3.前后轴的特化,附肢芽前后轴的极性：在肢芽能识别之前就已特化。 有两种主要模型用来解释前后轴的特化。
11、 一种是极化活动区（zone of polarizing activity，ZPA）可扩散形态发生子模型（ZPA diffusible morphogen model）。 另一种是极性坐标模型（the polar coordinate model）。,六、同源基因在附肢发育中的作用,现代研究认为附肢是通过特异基因在特定细胞中的表达决定的，同源基因可用于解释附肢发育中的所有主要现象。 同源基因决定附肢场附肢场的边界与诱导能力有关，而此边界是由同源基因的表达模式决定的。,渐进带的相互作用是由msx-1和msx-2基因调节的AER和位于其下的间质的相互作用是由msx-1和msx-2基因产物调节的。
12、msx-1基因起初在整个早期的附肢芽中表达，但此后变得局限于直接位于AER下方的渐进带间质中表达。msx-2基因起初是在AER和前部的间质中的表达。,由同源基因决定前后轴和指的特性 HoxD基因家族（Hoxd-9到Hoxd13）的表达模式在小鼠附肢芽的后部边缘是重叠的。这意味着在后部边缘产生小指的细胞表达所有这些基因，而在前部边缘形成拇指的细胞只表达Hoxd-9。显然，在不同Hox-D基因的表达中存在一个编码特化前后指的模式。,七、细胞死亡与指和关节的形成,脊椎动物附肢中特定细胞的死亡是可遗传的程序性细胞死亡，是进化过程中经自然选择形成的。细胞死亡在指/趾的成形过程中，特别是关节形成和手指的分离中起着重要的作用。,鸭胚和鸡胚后肢原基中细胞死亡模式的比较。,鸡胚趾间细胞的程序性死亡信号可能由BMP发出，封阻BMP的受体将会阻止这些细胞的程序性死亡。,noggin expression,dominant negative BMP receptor,BMP蛋白可能参与了软骨的稳定和关节的形成过程。鸡肢形成晚期，BMP7（A）和BMP2（B）的表达。,Noggin蛋白的作用。C，16.5天正常小鼠前肢中GDF5在关节形成处表达； D，Noggin缺陷型突变体小鼠中不表达GDF5，也不形成关节。,END,
