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1、,植物细胞 悬浮培养技术,单细胞的分离,由完整的植物器官分离单细胞 由培养组织（如愈伤组织） 中分离单细胞,1 由完整的植物器官分离单细胞,机械法 酶解法,叶片是分离单细胞的最好材料,1.1 机械法,方法A：用刀片刮叶片 (花生成熟叶片),具体方法:,方法B：叶片研碎、离心,研磨介质：40ml 20umol Sucrose 10umol MgCl2 20umol trisHCL (三羟甲基氨基甲烷 ) PH 7.8 注意：只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。,注意：大麦、小麦和玉米很难通过酶解法使细胞分离。 （叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间形成一种
2、互锁结构）,事例 分离篱天剑叶肉细胞的机械方法,10ml培养基 1.5克1cm2叶片,低速，去碎屑，游离细胞沉降,1.2 酶解法,Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞,1.3 机械法和酶解法比较,机械法,酶解法,细胞不受到酶的伤害； 不用质壁分离； 细胞产量低； 细胞易破。,细胞受到酶的伤害； 要质壁分离； 细胞产量高； 细胞不易破。,2 由培养组织（愈伤组织）分离单细胞,材料：胡萝卜肉质根,步骤：,1 诱导产生愈伤组织 2 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；,摇床用于振荡,3 Subculture 将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮
3、培养物,优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。,植物细胞悬浮培养 技术 （Suspension culture）,特点： 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出：悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。,概念：是指一种在受到不断摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统。,1、起始悬浮液的制备,2、悬浮培养的基本形式,分批培养 连续培养,2.1 分批培养（Batch culture）,2.1.1 含义：将细胞分散在一定容积的培养基中进行培养。 在培养过程中除了气体和
4、挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。 它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。,2.1.2 特点,培养基体积固定 当培养基中的营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长也停止 必须适当搅拌,2.1.3 继代的方法和最佳时期,继代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。 注意：要适当稀释,最佳继代时期： 选择指数生长期和直线生长期。,2.1.4 细胞生长曲线,在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。 细胞的生长呈S形曲线,滞后期 (lag phase
5、),指数生长期 (exponential phase),直线生长期 (linear phase),减慢期 (progressive deceleration phase),静止期 (stationary phase),1,2,3,4,5,滞后期 (lag phase),细胞很少分裂，其时间长短取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少,1,指数生长期 (exponential phase),细胞分裂活跃，细胞数目迅速增加,2,直线生长期 (linear phase),细胞生长和发育最快的时期,3,减慢期 (progressive deceleration phase),由于培养
6、基中某些营养物质已经耗尽，或是由于有毒代谢产物的积累，细胞的增长逐渐减慢,4,生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。,静止期 (stationary phase),5,小结： （1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。 （2）加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。 （3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持指数生长期。 （4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。,操作注意事项： 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（24
7、细胞），使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。,2.2 连续培养（Continuous culture）,加入培养基,排出培养基及其培养物,二者体积相等,分：开放式连续培养 封闭式连续培养,开放式和封闭式区别,封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不断增加； 开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出 。,连续培养意义： 植物细胞代谢调节的研究 某种生长限制因子对细胞生长的影响 次生物质的大量生产 紫杉醇是获得美国FDA(1992)认证的优良抗肿瘤药物。红豆杉
8、树皮中紫杉醇的含量为万分之二，其在国际市场上售价为20万美元/kg,由悬浮细胞再生植株的途径,由悬浮细胞直接形成体细胞胚 先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株,3 细胞悬浮培养的培养基,3.1 悬浮培养对培养基的要求 能用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培养基，一般也适用于建立该物种的悬浮培养。 在活跃生长的悬浮培养物中，无机磷酸盐的消耗很快，不久成为限制因子。,Noguchi等(1977)证明，把烟草悬浮培养物保存在一种含有标准的MS无机盐培养基中，培养开始3d之内无机磷酸盐的浓度就几乎下降为零，即使把培养基中磷酸盐的浓度提高到原来的水平的3倍，5d之内也会
9、被细胞全部用完。 高等植物的悬浮培养，B5和ER培养基。,3.2 条件培养基,把在液体培养基里 培养46周的高浓度细胞滤掉，而用他的培养基制成悬滴或薄层来培养单细胞或低密度细胞群体。,3.3 培养基的振荡,防治细胞缺氧死亡 防治大的细胞团的形成,3.4 悬浮培养细胞的同步化,同步培养： 指在培养中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。 应用：为了便于研究细胞分裂和细胞代谢,3.4.1 物理方法,A 按细胞团的大小 通过对细胞物理特性（细胞或小细胞团的大小）的控制，以实现高度的同步化 B 低温休克法 通过对生长环境条件（光照、温度等）的控制，以实现 高度的同步化,3.4.2 化学方法,A 饥
10、饿法 先对细胞断绝一种细胞分裂所必须的营养物质成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。,细胞周期（cell cycle)是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。 间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。 细胞分裂期：前期，中期，后期，末期,3.4.2 化学方法,B 抑制法 使用DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶、羟基尿和胸腺嘧啶脱氧核苷 当细胞受到化学药物抑制时，细胞周期只能进行到G1，细胞滞留在G1期S期的边
11、界上。,4 悬浮培养中细胞生长量的计算,细胞计数 细胞密实体积（PCV）,5铬酸或0.25果胶酶使悬浮细胞团分散 用血球计数板进行。,将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一个 15ml 的离心管中，3000rpm离心，用每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。,细胞鲜重 细胞干重,细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培养基，真空抽滤，称重。 细胞干重：60干燥12h，称重。 以每毫升培养物或106个细胞的重量表示。,5 培养细胞活力的测定,相差显微术法 TTC法（2,3,5-氯化三苯基四氮唑） FDA法（荧光素双醋酸酯法） 伊凡蓝法(Evans blue)（FDA的互补法）,根据细胞质环流和细胞核存在与否
12、，鉴别细胞的死活。 环流正常、核存在表明有活力；,在活细胞中，TTC被还原成红色甲鐟，提取甲鐟用分光光度计检测。,活力受损的细胞能够摄取这种染料，完整的活细胞则不能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞,FDA法的原理,FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。,FDA,荧光素,步骤：,活细胞,死细胞,FDA先用丙酮配成0.5%的母液，终浓度为0.01%,思考题：,如何得到植物离体单细胞？ 植物细胞悬浮培养有哪些方法？ 简述悬浮培养细胞同步化的方法 简述悬浮培养中细胞生长的计量方法 如何获得同步化的培养细胞？,
