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1、CRISPR-Cas9系统基因修饰理论与实战,1 基因表达研究方法,干扰基因表达（过表达或低表达），或者表达突变体并检测其相关生理功能，是基因功能研究中最重要的方式之一；基因表达技术- 质粒转染，病毒转染等传统方法得到广泛运用，但同时其也存在缺点；,1 基因修饰的方法与各自优势,质粒- 瞬时转染 - 某些细胞效率偏低 - 表达结果不稳定，有内源表达的干扰； 质粒- 稳定细胞 - 表达结果不稳定，筛选效率不高，在重组插入基因组中可能干扰其它基因表达； 病毒- 瞬时感染 - 表达结果不稳定，质粒容易在细胞复制过程中丢失，随机插入基因组中可能会干扰其它基因表达；新一代的基因编辑技术- 利用重组酶在基
2、因组水平修饰基因，产生的遗传性质稳定，直接作用于内源，减少表达干扰，目前有成熟的技术如CRISPR/Cas9；,DNA,NHEJ and HDR,DNA修复的机制与基因编辑原理,非同源性末端接合修复机制(Non-homologous end joining, NHEJ),同源介导的修复机制(Homology-directed repair, HDR),5,ZFN and TALEN,ZFN与TALEN基因编辑原理,6,Le C, F Ann R, David C, et al. 2013, Science, (6121):819-823.,Genome Editing in Mammalian
3、 Cells,1 CRISPR-Cas概述,CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。,CRISPR-Cas主要由两部分组成：,识别,切割,1 CRISPR-Cas概述,1.1 CRISPR结构,CRISPR： （clustered regularly interspaced short palindromic repeats）CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 2148 bp, 重复序列之间被 2672
4、 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。,1.1 CRISPR结构,1.2 Cas家族,Cas（CRISPR associated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,2 CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。,2 CRISPR-Cas系统的发现,2 CRISPR-Ca
5、s系统的发现,2 CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,最主要的要求： PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。,2 CRI
6、SPR-Cas系统靶向要求,3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰,3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换,2013年1月29日在nature biotechnology上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。,3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,2013年1月29日在nature biotechnology上发表的efficient g
7、enome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,Cas9,sg-RNA,2013年2月15日在science上发表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。,3
8、.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰,3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰,4 CRISPR-Cas系统前景分析,这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有可能获得诺贝尔奖技术。,4 CRISPR-Cas系统前景分析,2013年4月12日在cell stem cell上发表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。,4
9、 CRISPR-Cas系统前景分析,而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。,4 CRISPR-Cas,只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。 较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。,技术优势,5 我们的工作 利用CRISPR-Cas9载体肿瘤基因M在卵巢癌细胞HeLa的编辑与敲除,流程- a.sgRNA的引物设计（4条
10、）； b.px459-cas9载体构建 ，HeLa细胞上的转染与基因靶点筛选（1次）； c.母克隆的基因剪切的确定（2-3个母克隆）； d.单克隆筛选（2-3轮，100个子克隆） f. 单克隆的鉴定（Q-PCR以及WB检测）；,母克隆8-31-M测序,子克隆8-31-12-d-M测序,5 我们的结果 成功获得了M基因敲除的HeLa细胞系，,模板 CCCGGCAGGCTGGACAC-TTCGTGGAGGGCTCCAAAG 11-5-1 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失2个碱基，移码） 11-5-2 CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGC
11、TCCAAAG (缺失6个碱基，不移码） 11-5-3 CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGCTCCAAAG (缺失6个碱基，不移码） 11-5-5 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失2个碱基，移码） 11-5-4 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失2个碱基，移码） 11-5-6 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失2个碱基，移码） 11-18-1 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失2个碱基，移码） 1
12、1-18-2 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失2个碱基，移码） 11-18-4 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG (插入1碱基，移码) 11-18-6 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失2个碱基，移码） 11-18-8 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失2个碱基，移码） 11-18-9 CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGCTCCAAAG (缺失6个碱基，不移码） 11-18-5 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG (插入1碱基，移码) 11-18-7 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG (插入1碱基，移码),5 我们的结果 验证肿瘤增殖、迁移等功能受到影响；,
