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1、植物细胞离子通道,植物细胞膜系统和离子通道,膜片钳技术简述,植物根系不仅从土壤中吸收水分，还要吸收各种矿质元素，以维持正常的生命活动，促进植物的生长发育目的获得高产优质如：小麦、水稻、玉米、烟草、蔬菜、水果等 植物吸收矿质元素首先细胞从环境中吸收，这个环境可以是植物的生存外部环境，如土壤，也以是植物本身的内部环境 肥料离子吸附交换细胞 被动吸收：外液浓度细胞浓度 吸收 主动吸收：外液浓度细胞浓度 吸收 积累离子被动吸收： 扩散作用：指分子或离子沿着化学势梯度或电化学势梯度转移的现象楞思特方程式：,协助扩散：指小分子物资经膜转运蛋白顺浓度梯度或电化学势梯度的转运 转运蛋白：膜上具有转运功能的蛋白
2、质又称传递蛋白 分为二类：载体蛋白通道蛋白 载体蛋白：是一类内部蛋白，由载体蛋白转运的物质首先与载体蛋白的活性部位结合，结合后载体蛋白发生构象变化，被转运的物质释放到细胞内。 载体蛋白转运物质具有饱和现象。 通道蛋白：由细胞膜中一类内部蛋白构成的孔道，或有的称膜中由大分子组成的孔道 又叫离子通道。可被化学方式或电化学方式激活，控制离子顺势流过细胞膜，在形成维持跨膜离子梯度和信号传导等生理过程起重要作用。 检测：膜片钳技术 取几平方微米细胞膜或者全细胞膜，测定跨膜离子电流的大小，即在保持跨膜电压恒定的条件下，测定通过膜上离子通道的离子流大小。 其原理，欧姆定律 ：,分析膜上的离子通道，细胞间的离
3、子运输，气孔运动，光受体，激素受体，及信号传导，广泛应用。,植物细胞特点,细胞壁,液泡,叶绿体,植物细胞膜系统和离子通道,植物细胞膜系统,植物细胞膜系统和离子通道,植物细胞膜系统和离子通道,植物吸收离子涉及到质膜上的转运蛋白。膜转运蛋白分为两类：载体蛋白也称载体或转运体。它与特定的离子结合，发生构象变化，把离子转运过膜。通道蛋白也称离子通道是由膜中大分子组成的孔道或是由膜中一类内在蛋白组成的孔道。当这些通道打开时，准许特定的离子跨膜通过。,植物离子通道的概念,植物细胞膜系统和离子通道,1. 离子转运的被动性 2. 离子的选择性和导度(离子导度：离子跨暯的能力，电阻的倒数，反应通过离子通道通过离
4、子多少。 ) 3. 通道门控特性 4. 离子转运的高效性 5. 饱和现象 （离子跨膜运输可 分 为被动运输和主动运输两类。由 扩散作用或物理 过程所决定的运输属于被动运输；逆浓度梯度或电位梯度 运输 ，需要消耗能量属于主动运输。离子通道 与载体蛋白都能准许离子沿浓度梯度或电势梯度扩散，但二者的转运离子的速度有明显差异。载体蛋白每秒可转运104-105个离子，转运效率低，而离子通道秒可转运106-107个离子，高出1001000倍，转运效率高。原因：经载体蛋白转运离子需要与特定的离子结合，结合的部位数量有限，具有饱和现象，而离子通道则没有。）,植物离子通道的特点,离子通道类型,根据影响离子通道开
5、放的条件可将离子通道分为三大类:( 1) 电压依赖性: 这种离子通道的开启和关闭状态取决于膜电位的电压。细胞内钠、钾、钙、氯通道都属于电压依赖性通道。( 2) 配体门控性: 这种离子通道的开启和关闭取决于各种递质与通道上受体的结合状态。例如神经细胞膜上的乙酰胆碱受体通道, 该通道的递质为乙酰胆碱, 其与特异性受体结合时则通道开放, 解离时则关闭。( 3) 机械敏感性: 由细胞膜表面的应力变化控制通道的开放与关闭状态。其中以电压依赖性通道最常见,植物细胞膜系统和离子通道,根据生物学功能的特性将离子通道分为三类: ( 1) 电压门控的离子通道,包括Na+、K+、Ca2+ 通道等; ( 2) 受体激
6、活的离子通道, 包括神经递质、激素等外源性化学物质以及机械和渗透压力刺激所激活的离子通道; ( 3) 第二信使激活的离子通道, 包括由细胞内Ca2+、IP3、G 蛋白及蛋白激酶激活的离子通道。,植物细胞膜系统和离子通道,植物细胞离子通道类型,自从在蚕豆保卫细胞膜上发现植物离子通道以来，人们对植物细胞乃至作为细胞器的液泡膜上离子通道的认识迅速深入,到目前为止，已经发现植物细胞及其内膜上存在多种离子通道。,植物细胞膜系统和离子通道,植物质膜上的离子通道,植物细胞膜系统和离子通道,阴离子通道,K+通道,内向整流通道 : K+in,外向整流通道 ：K+out,Ca2+通道,Cl- , NO3-,液泡膜
7、上的离子通道,植物细胞膜系统和离子通道,1. 慢流动型通道(SV型),对阳离子具有选择性,许多一价阳离子( K+ , Na+ , Cs+ ) 和二价阳离子(Ca2 + , Mg2 + , Ba2+ ) 都可通过此通道，而且Cl - 也能极少量的通过。,2. 快流动型通道(FV型),具有电压依赖性,对阳离子具有选择性。,3. 钾离子通道(VK),与FV型通道类似,VK通道是一种不连续的瞬间激活的通道。它不具有电压依赖性,这是该通道与FV 通道的最大区别。,5. 阴离子通道,电压激活的液泡钙(VVCa) 通道 肌醇1 ,4 ,5-三磷酸( IP3) 门控的钙通道 cADPR 门控的液泡通道,4.
8、钙离子(VCa) 通道,苹果酸(VMAL) 通道 氯离子(VCl) 通道,内向型K+通道AKT1结构模型示意图,植物细胞膜系统和离子通道,具有6个保守的跨膜结构域，其中S4结构域具有电压感应作用，S5与S6之间有一个形状如发卡的疏水区域，这个结构区域构成离子通道的孔道部分，具有结合离子的位点。,钙离子通道调节细胞生理活动的模型,植物细胞膜系统和离子通道,离子通道的功能,植物细胞膜系统和离子通道,1.离子的吸收和转运 研究K离子吸收有二 种途径： 高亲和性 K离子吸收途径,一般浓度为1200molL-1范围内起作用 低亲和性K离子吸收途，一般浓度为110molL-1范围 内起作用径2.渗透和代谢
9、调节, 例如，气孔运动 3.信号传导， 例如，钙离子是细胞中重要的第二信使之一4.调节膜电位，例如，植物细胞的动作电位 5.决定细胞的分裂和生长方向，钙离子通道能调节细胞分裂和生长。,植物体内的离子通道参与了植物生长发育衰老死亡的全过程。,离子通道与细胞信号转导,保卫细胞离子通道参与了ABA信号转导过程,植物细胞膜系统和离子通道,离子通道分子水平的研究概况, KATI：从拟南芥中鉴定出来的钾离子运输蛋白，是电压依赖型内向性通道，在拟南芥保卫细胞和茎根的维管组织中表达，参与气孔开发，并向维管组织中转运钾离子，不能从土壤中吸收钾离子。拟南芥中的KATI可编码667个AA, 分子量为79KD. AK
10、TI：从效母突变体中采用互补法筛选出来。在根组织中表达，能从土壤 中吸收钾离子，可编码856个AA, 分子量为97KD.这两个基因已导入水稻和烟草,具有较强吸收钾离子能力. KCOI：从拟南芥数据库中筛选出来的外向型钾离子通道，转运钾离子时依赖胞质中钙离子，在植物各个部位均有表达，在亚细胞水平上在液泡暯上。 LKTI：从西红柿根毛特化的cDNA 库克隆出来，LKTI 的 m RNA 在 根中表达。 ZMK1 和 ZMK2：从玉米胚芽鞘中分离的钾离子通道基因，ZMK1在外部酸性化时激活 Kin通道，ZMK2电压依赖型。 TaAKTI：从小麦根中分离的，具有与拟南芥KATI氨基酸顺序76%，属于K
11、in通道。,AtKUPI： 该基因是通过校母突变体 互补性分析得到的，呈现 “两相”形式，从高亲和相Km 为44M性到低亲合相Km值为11mM性的转变范围在100200M外界钾离子浓度.高低和 亲系统受到5mM 和更高浓度的抑制.也受到钾离子通道阻断剂的抑制,在根中表达,不同钾含量的土壤中吸收钾.木质部壁细胞含有3个阳离子通道： KORC： 为外向型钾离子通道, 调节钾从木质部壁细胞释放到导管中. KIRC：为内向型钾离子通道,调节钾从木质部转移到周围壁细胞重新吸收 NORC： 非选择性外向整流阳离子通道，能把盐分释放到木质部的导管，还负责电信号和水力学信号的传导。,离子通道问题和展望,生理作
12、用调控的分子机理基因的转化和应用,膜片钳技术由来,电压钳技术示意图,电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流, 抵消离子通道开放时所产生的离子流, 从而使细胞膜电位固定在某一数值. 由于注射的电流与离子流大小相等、方向相反, 因此它可以反映离子流的大小和方向. 电压钳技术是一种研究可兴奋细胞电生理特征的基本手段和方法, 但在应用上具有其局限性:1) 双微电极钳位法只适用于巨大的神经轴突、肌肉纤维和卵母细胞等较大的细胞, 对于直径小于10 微米的细胞, 胞内插入两根电极就很困难, 虽然此时可用单根吸附电极进行电压钳位, 但是对细胞膜的损伤也不可避免;2) 只能采用全细胞记录模式, 记录到的是整个细
13、胞膜上所有开放通道的电流总和, 无法了解单通道电流的情况;3) 由于电压钳微电极尖端很细( 电阻大) , 会影响记录电流的能力。,膜片钳技术简述,膜片钳技术原理,膜片钳技术是用微玻管电极膜片电极或膜片吸管接触细胞膜, 以千兆欧姆以上的阻抗使之封接, 使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域膜片与其周围在电学上分隔, 在此基础上固定电位, 对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法.,膜片钳技术简述,膜片钳记录方法,单通道记录法（Single channel mode）:细胞吸附式(Cell-attached mode)、膜内面向外 Inside -out）、膜外面向外(Outsid
14、e-out)、开放的细胞吸附式膜内面向外(Open cell-attached inside-out mode)和穿孔囊泡膜外面向外（Perforated-vesicle outside-out mode）; 全细胞模式记录法（Whole-cell mode）:孔细胞模式(Hole cell mode)、穿孔膜片模式(Perforated patch mode)或制真菌素膜片模(Nystatin patch mode)，也称缓慢全细胞模式（Slow whole-cell mode ）。,膜片钳技术简述,全细胞钾离子通道电流,单通道记录钙离子通道电流,膜片钳技术简述,膜片钳（仪器）,抛光仪,拉制
15、仪,显微镜操作系统及可见光源,膜片钳技术简述,膜片钳放大器、操作系统,冷光源,膜片钳技术简述,低温水浴摇床,膜片钳技术简述,材料的好坏直接影响膜片钳实验的成败！,要根据不同的实验目的来栽培材料。 根细胞：通常根长度在2厘米左右，但突变体要根据该基因起作用的发育阶段来确定； 保卫细胞：通常在土壤中生长4-6周，但绝不能抽苔；叶肉细胞对光照要求较高，因为光照直接影响叶绿体的活动。,膜片钳技术步骤,膜片钳技术简述,实验试剂,蚕豆保卫细胞钾通道实验溶液 （1）基本缓冲液：KCl 50mmol/L、Mes 10mmol/L、pH6.1(KOH) （2）基本介质：甘露醇0.45mol/L、CaCl2 0.
16、5mmol/L、MgCl2 0.5mmol/L、抗坏血酸 0.5mmol/L、KH2PO4 10mol/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)。 （3）第一酶液：Cellulysin 0.7%、PVP-40 0.1%、牛血清白蛋白（BSA）0.25%，溶于45%的基本介质中。 （4）第二酶液：Cellulase RS 1.2%、Pectolyase Y-23 0.01%、BSA 0.25%、抗坏血酸 0.5mmol/L，溶于45%的基本介质中。 （5）细胞外液：谷氨酸钾 10mmol/L、MgCl2 2mmol/L、CaCl2 1mmol/L、KOH 1mmol/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)，用甘露醇调节渗透压为460mOmol/Kg。 （6）电极溶液：谷氨酸钾 100mmol/L、MgCl2 2mmol/L、KOH 4mmol/L、MgATP 1.1mmol/L、CaCl2 0.1mmol/L、Hepes 10mmol/L、pH7.2 (KOH), 用甘露醇调节渗透压为510mOmol/Kg。,
