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1、基因信息的传递及其调控,武汉大学医学院病毒所,细胞的生物学性状是由其遗传物质携带的遗传信息所决定，绝大多数生物的遗传物质是DNA，少数噬菌体和病毒的是RNA。基因，gene是细胞内遗传物质的最小功能单位，是负载有特定遗传信息的DNA片段，其结构一般包括DNA编码序列、非编码调节序列和内含子。基因的功能是为生物活性物质编码，其产物为各种RNA和蛋白质。蛋白质是生命活动的执行者，基因能通过转录和翻译，由DNA决定蛋白质一级结构，从而决定蛋白质的功能。同时基因还能通过复制将遗传信息代代相传。,1958年，Crick提出分子生物学的“中心法则”，central dogma，阐明了从DNA到蛋白质的遗传
2、信息流动方向和过程。最初的中心法则认为遗传信息包含在DNA的碱基顺序中，通过DNA的复制使其代代相传；DNA遗传信息通过转录传递给mRNA，再通过翻译传递给蛋白质，生物的性状由蛋白质决定遗传信息的传递可以由DNA到DNA，DNA到RNA， RNA到蛋白质，但遗传信息一旦进入蛋白质就不能再传出。,分子生物学的中心法则,这些观点涵盖了大多数生物遗传信息贮存和表达的基本规律。1970年，Temin发现了逆转录现象和逆转录酶，表明少数RNA也是遗传信息的携带者，并阐明了生物界中另外一种遗传信息的流动方向，从而使“中心法则”更加完善而最近“朊病毒，prion”概念的提出，表明蛋白质也可能是遗传信息的载体
3、，这一观点对中心法则提出了挑战。,就单个生物体而言，其所有细胞都具有同样的基因，然而不同组织细胞的基因表达情况不同，有些基因被启动进行表达，有些基因被抑制不表达或少表达。即使在同一类型细胞的不同发育阶段，基因表达情况也有不同。基因表达调控遵循一般的规则，即一个体系在需要时被打开，不需要时就被关闭或抑制。这种基因“开”和“关”的控制是通过对基因信息传递过程的多个环节来实现的。,第一节基因转录和转录后加工,基因转录是RNA合成的主要方式和基因信息表达的重要环节，是遗传信息从DNA向RNA传递的过程。转录生成的RNA是初级转录产物, primary transcripts，必须经过不同方式的加工和修
4、饰才具有生物活性。,以DNA为模板合成RNA的过程称为转录, transcription，即把DNA的碱基序列转抄成 RNA。 在这个过程有很多因素参与其中，包括 1. DNA模板, template 2. RNA聚合酶, RNA polymerase 3. 三磷酸核糖核苷, NTP 4 .一些与转录相关的蛋白因子,转录将基因信息从DNA传递到蛋白质,(一) 转录是基因信息从DNA传递到蛋白质的重要环节DNA碱基排列顺序决定了编码蛋白质的氨基酸序列，是蛋白质合成的原始模板。mRNA是蛋白质合成的直接模板，其他几种RNA是参与翻译过程的重要因子。通过基因转录遗传信息从细胞核转运到细胞质，从功能上
5、衔接了DNA和蛋白质这两种生物大分子。基因转录具有以下特点： 1合成RNA的底物是5-三磷酸核苷，包括ATP、GTP、CTP和UTP。 2在RNA聚合酶作用下一个NTP的3-OH和另一个NTP的5-P反应，形成磷酸酯键。 3RNA碱基顺序由模板DNA碱基顺序决定，依靠NTP与DNA碱基配对的亲和力被选择。,4在被转录的双链DNA分子的任何一个特定区域都是以单链为模板。 5RNA合成的方向是5一3，生成的RNA链与模板链反向平行，游离的NTP只能连接到RNA链的3-OH端。6在RNA的合成中不需要引物。,DNA双链的不对称转录,(二)DNA链是基因转录的模板DNA双链上有转录的启动部位和终止部位
6、，两者之间的核苷酸序列是遗传信息的储存区域，在转录时起模板作用。在基因组全长DNA链中只有部分DNA片段能发生转录，这种能转录出RNA的DNA区域称为结构基因，structural gene。DNA链这种选择性转录也称为不对称转录，asymmetric transcription，它有两方面含义：,在DNA分子双链上，总是只有一股链用作模板指引转录，另一股链不转录。能指引转录生成RNA的DNA单链称为模板链，template strain，有时也称为有意义链，sense strain或Watson链；相对于模板链不指引转录的另外一股DNA单链称为编码链，coding strain，又称为反义链
7、，antisense strain或Qick链。 模板链并非总是在同一单链上。在DNA双链某一区段，以其中一单链为模板，而在另一区段，又反过来以其相对应单链为模板。,(三)RNA聚合酶是基因转录的关键酶 基因转录过程本质也是一个以核糖核苷酸为底物的多步酶促反应过程，这些反应需要有转录酶催化，转录酶，transcriptase即RNA聚合酶，又称DNA依赖的RNA聚合酶，DNA dependent RNA polymerase。该酶分布于原核细胞的胞液和真核细胞的胞核，分别催化转录的进行。,原核生物细胞的RNA聚合酶只有一种类型，能催化各类RNA包括mRNA、rRNA、tRNA的生物合成。目前研
8、究得比较清楚的是大肠杆菌的RNA聚合酶，它在执行不同的 生理功能时分别以全酶，holoenzyme和核心酶，core enzyme两种不同的状态存在。 全酶由四种5个亚基组成,2，核心酶由全酶的2四个亚基组成。 亚基又称因子，它本身并没有催化活性，其作用是识别DNA模板上的启动子，辨认转录起始位点。,亚基结合到核心酶上后可能引起酶构型的变化，改变了核心酶与DNA结合的特性。核心酶的作用是使已开始合成的RNA链延伸，亚基可以单独与DNA结合，它参与RNA聚合酶与DNA模板反应，也可能与核心酶和亚基结合以及转录的终止有关。亚基具有与亚基结合的位点，参与特定的基因表达，与酶和DNA上启动区域的反应有
9、关。试管内的转录试验证实，单纯的核心酶就能催化NTP按模板的指引合成RNA，但合成的RNA没有固定的起始位点。由此可见，活细胞在转录开始需要全酶，但在转录延长阶段，亚基从全酶上脱落，仅剩下核心酶维持转录进行。,A 大肠杆菌RNA聚合酶全酶 B 酝酒酵母RNA聚合酶全酶,真核生物细胞有三种类型的RNA聚合酶，分别称为RNA聚合酶、。它们专一性地转录不同的基因而合成各不相同的产物。 RNA聚合酶的转录产物是45S-rRNA，经剪接修饰生成除5S-rRNA外的各种rRNA RNA聚合酶的转录产物是mRNA的前体hnRNA RNA聚合酶的转录产物是一些小分子量RNA，如5S-rRNA、tRNA、snR
10、NA等 真核细胞RNA聚合酶结构比较复杂，往往由多个亚基组成，如图为酿酒酵母RNA聚合酶，由12个亚基组成。,(四) DNA模板上启动子是控制转录的关键部位基因转录的第一步就是RNA聚合酶结合到模板DNA分子上，结合的部位称为启动子，promoter，它是结构基因上游的调控序列，是控制转录的关键部位，该区域含有较多的AT配对。对多种原核生物基因转录起始区的分析发现，如果以开始转录生成RNA 5端第一个脱氧核苷酸的位置为1，以负数表示上游的碱基序数，那么不同基因的启动子之间存在着保守序列或一致性序列。,碱基序列分析结果表明，启动子-10区的保守序列为TATAAT，该区由Pribnow首先发现，称
11、为Pribnow盒。Pribnow盒能决定转录的方向，在Pribnow盒区DNA双螺旋解开与RNA聚合酶形成复合物。35区位于Pribnow盒的上游，是启动子中另外一个重要区域，该区域也存在着类似于Pribnow盒的共同序列TTGACAT。目前认为-35区是RNA聚合酶对转录起始的辨认位点。 RNA聚合酶与-35区辨认结合后，能向下游移动，达到-10区的Pribnow盒，在该区RNA聚合酶能和解开的DNA双链形成稳定的酶-DNA开放启动子复合物，就可以开始转录。,不同启动子碱基序列的比较分析,RNA聚合酶和启动子形成酶-DNA复合物,转录过程可分为三个阶段(一)包含RNA聚合酶的转录起始复合物
12、形成标志转录开始RNA合成起始首先由RNA聚合酶的因子辨认DNA链的转录起始点，介导核心酶与DNA链接触。被辨认的DNA位点是启动子-35区的TTGACAT序列，在此区段酶-DNA松散结合并向下游的-10区移动，在-10区形成稳定的酶DNA复合物，进入了转录的起始点。,RNA聚合酶与DNA模板的结合能使该部位的DNA双螺旋解开，形成局部的单链区，并构成了转录起始复合物,RNA聚合酶全酶、DNA链和新链前两个核苷酸。该复合物一旦形成,RNA聚合酶就开始合成RNA。转录起始不需要引物，RNA聚合酶能直接把两个与模板配对的相邻核苷酸通过形成磷酸二酯键连接起来。由于RNA聚合酶常选择DNA链上胸腺嘧啶
13、开始转录，因此在形成的新RNA链的第一个核苷酸常是ATP或GTP。 当转录复合物形成第一个磷酸二酯键后，因子即从复合物上脱落下来，反复用于转录起始过程。核心酶继续结合于DNA模板上并沿DNA链前移，进入延长阶段。,(二)转录空泡是转录延伸阶段的主要形式因子从起始转录复合物上脱落下来后，能引起核心酶和亚基的构象发生改变。在起始区DNA有特殊的碱基序列，酶和模板的结合具有高度的特异性，并能形成稳定的转录复合物。离开起始区后，随着碱基序列和核心酶构象改变，酶和模板的结合比较松散，有利于核心酶迅速向前移动。,当核心酶沿着模板向前移动时，结合下一个能与模板配对的核苷酸，进行一次酶促连接反应。转录延长的每
14、一次化学反应都可以使RNA链增加一个核苷酸，而且RNA产物中没有T，当遇到模板中A时，转录产物相应加U。由于RNA聚合酶比较大，能覆盖转录区中解开的DNA双链以及新合成RNA链和DNA链形成的杂化双链，构成RNA聚合酶-DNA-RNA的转录复合物，这是转录延伸阶段的主要形式，也称为转录空泡，transcription complex。,转录过程中只有RNA聚合酶覆盖区域DNA才解开双链，形成松散结构，而当RNA聚合酶前移时，原来位置DNA单链重新形成双链螺旋，这和复制过程的复制叉不同。 新合成的RNA链3端依附在转录空泡上用于同下一个核苷酸的连接，其5端由于DNA双链重新结合而离开模板伸展在空
15、泡之外，形成电镜下观察到的羽毛状转录图形。,基因的转录过程,(三)原核生物的转录终止有两种不同方式当核心酶沿模板3一5方向移行至DNA链的终止部位时，识别模板上特殊结构后便停顿下来不再移动，同时转录产物RNA链从转录复合物上释放出来，即转录终止。原核细胞和真核细胞转录终止机制和方式并不相同，这里主要探讨原核生物的转录终止。原核生物的转录终止分为 两大类，依赖因子, Rho factor的转录终止和不依赖因子的转录终止。1依赖因子的转录终止 因子是由6个相同亚基组成的六聚体蛋白，它具有两大生物活性：解螺旋酶活性；依赖RNA的ATP酶活性。,一般认为， 因子能对含有Poly C的RNA有较强的亲和
16、力，转录终止阶段新合成RNA链出现富集的Poly C序列， 因子与其结合后能向RNA聚合酶方向移动，移动需要的能量来自于ATP酶水解ATP提供。p因子接触RNA聚合酶后，二者的构象发生改变，并利用其解螺旋酶活性拆离DNA-RNA杂化双链, 从而使转录产物从转录复合物中完全释放出来，转录终止。,因子参与转录终止过程,2非依赖因子的转录终止 此种转录终止不需要蛋白因子参与，而是利用新合成的RNA链自身的某些特殊结构来终止转录。在DNA模板链接近转录终止的区域内有较密集的A T配对区和自身互补序列，这样使转录产物RNA的3端常有若干个连续的U序列和自身互补序列形成的茎环，stemloop结构或发夹结构，hairpin structure。这两种结构是阻止转录继续进行的关键，其原因可能在于，发夹结构形成可能改变了RNA聚合酶构象，导致了酶-模板结合方式的改变，RNA聚合酶则不再向下移动，同时连续的U序列也能促进RNA聚合酶从模板上脱落下来。,
