兽医生物制品学_ 第三章灭活剂保护剂和免疫佐剂课件

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1、1,第三章 灭活剂、保护剂和免疫佐剂 第一节 灭活剂 一、灭活与灭活剂 1、灭活概念是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能不影响其免疫原性，被灭活的微生物主要用于生产灭活疫苗；或指破坏 诊断血清或待检血清中的补体活性，以避免补体对诊断试验的干扰作用。微生物毒力的灭活或毒素毒性灭活或补体活性灭活 2、灭活方法物理方法（不用）化学方法（常用） 3、灭活剂：用于灭活微生物的化学试剂或药物称为灭活剂,2,二、常用灭活剂的灭活机理与应用(一) 灭活剂种类 1、甲醛溶液：蛋白质 核酸烷基化（不加中断剂） 2、烷化剂 乙酰基乙烯亚胺（AEI） 二乙烯亚胺(BEI) 缩水甘油醛（使微生物核酸烷

2、基化,灭活后加2%硫代 硫酸钠中断灭活） 3、苯酚（石炭酸）：用于防腐， 很少用于疫苗研制 4、结晶紫：蛋白质变性。（溶于有机溶剂）用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原 5、-丙酰内酯病毒灭活剂，为狂犬病灭活苗制备所用.注意：灭活剂对人有害， 有时对皮肤粘膜有强烈刺 激性如：甲醛、-丙酰内酯,3,1、甲醛溶液： 规程（2000）中的26种灭活疫苗灭活机理：灭活浓度：多数为0.10.3灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的；必要时可在灭活后加入硫代硫酸钠，以中断其反应。,氨基 甲基胺,羧基 亚甲基二醇单酯,巯基 亚甲基二醇,甲醛醛基,羟基 羟基甲酚,4,2、烷化剂（alkylating age

3、nt）乙酰基乙烯亚胺（AEI)、二乙烯亚胺(BEI) 、缩水甘油醛 灭活机制：1. 烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，引起单链断裂或双螺旋链交联，因改变DNA的结构而破坏其功能，妨碍RNA的合成，从而抑制细胞的有丝分裂。2. 与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。 优点：能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而 不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。,5,1）乙酰基乙烯亚胺（N-acetyl ethylenimine，AEI） 淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。 04可保存1年，在-20可保存2年 AEI功能基团是乙烯亚胺基，可用于口蹄疫灭活苗。 口蹄疫病毒液: 终浓度0

4、.05，308h, 加2硫代硫酸钠阻断 2）二乙烯亚胺（binary ethylenimine，BEI） 市购商品为0.2的BEI溶液，在04可保存1个月; 终浓度0.02%, 加入2硫代硫酸钠中断灭活。,6,3）缩水甘油醛（glycidaldchyde，GDA） 大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。 本品易挥发，水溶液含量为1531mg/ml。 04 3个月含量渐下降，约半年失效；20只能保存10d。,7,3、苯酚（石炭酸）：用于防腐， 很少用于疫苗研制 4、结晶紫：蛋白质变性。（溶于有机溶剂）用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原,8,4、-丙酰内酯（propiolactone）又名羟基

5、丙酸-内酯 无色有刺激气味的液体，水溶液应密封于玻璃瓶中5保存 水中溶解度37，能与丙酮、醚和氯仿任意混合 对皮肤、粘膜及眼有强刺激性，对动物有致癌性。 病毒灭活后，能保持良好的免疫原性 主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。,9,三、影响灭活作用的因素 1、灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛最常用。 2、微生物种类和特性 3、灭活剂浓度（一定要适合） 4、灭活温度（具体不同病原体或毒素，其灭活时间和温度不一致） 5、灭活时间 6、灭活PH值 7、有机物存在,10,第二节 保护剂（稳定剂） 保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质

6、。（指对疫苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生物或细胞） 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO)DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方） 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖,11,保护剂（protector）的分类,分类： （根据其作用机理） 渗透剂：如二甲基亚砜（DMSO）、甘油和蔗糖等 非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质等 （根据其分子量大小） 高分子物质、低分子物质。 （按其化学性质） 复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物,1

7、2,复合物 脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等 糖类 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等 盐类 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等 醇类 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等 酸类 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 聚合物 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等,一些常用的冷冻干燥保护剂,分 类 保 护 剂,13,疫苗冻干保护剂组成 1. 营养液：可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，增加溶解度 2. 赋形剂：防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响使冻干制品形成多孔性、疏松的海

8、绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂：抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存 期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。,14, 防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生物活性物质的损伤； 降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保持细胞的活力； 保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复苏和迅速修复自身。,冻干保护剂作用机制,15,二、影响保护剂效能的因素1、保护剂种类: 根据微生物种类或者用途来添加不同种 类保护剂。 、保护剂浓度：严格按照配方执行。 、保护剂配制方法：糖类不能用121高压灭菌处理。 、保护剂酸碱度（PH值）,16,三、常用的冻

9、干保护剂（稳定剂）明确不同种类微生物需要添加不同保护剂 （一）细菌的保护剂 需氧或兼氧厌氧菌：蔗糖脱脂乳或蔗糖、 1.5明胶； 厌氧性细菌：含1.5谷氨酸钠的乳糖或10脱脂乳或7.5葡糖血清。注：脱脂乳：20脱脂奶粉溶于水配制而成。 （二）病毒的保护剂 5%蔗糖 脱脂乳； 马立克814活细胞疫苗:保存液氮.稳定剂为10%二甲基亚砜和50%犊牛血清的199液。注意: 微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有不同的配方。,17,谷氨酸钠 乌苷酸钠 呈味核苷酸二钠 “超鲜味精”。它的主要化学成分是2甲基呋喃苷酸。它比味精要鲜上600多倍！ 现代的味精商业化生产是通过淀粉、甜菜、甘蔗或糖蜜培养基发酵生

10、产的。 氨酸钠对婴儿生长发育有不良影响，它能同婴儿血液中的锌发生特异性结合，生成不能被机体吸收的谷氨酸锌，随尿排出体外，导致婴儿缺锌，进而造成婴儿味觉变差，智力减退，厌食，生长发育迟缓及性晚熟等。因此，哺乳期妇女应尽量少食味精，三个月龄的婴儿应忌食味精，一周岁以内也不食味精为宜。成人的味精摄入量以每天每公斤体重不超过0.12克为宜。,18,15%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂 蔗糖（或乳糖）5g，加脱脂乳至100ml，充分溶解后，110116高压灭菌3040 min。 羊痘 新城疫、鸡痘 2明胶蔗糖保护剂 明胶 2%3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%2%（g/m1）。先将12%18%

11、明胶液、30%蔗糖液和6%12%硫脲液加热溶解，116高压灭菌3040min； 猪肺疫 猪丹毒,兽医生物制品常用的保护剂,19,3SPGA保护剂 蔗糖 76.62g、磷酸二氢钾0.52g、磷酸氢二钾1.64g、谷氨酸钠0.83g、牛血清白蛋白10g、加去离子水至1000ml，混合溶解，过滤除菌。 鸡马立克病火鸡疱疹病毒活疫苗,20,第三节 免疫佐剂,一、佐剂概念与作用机理 1. 佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质称为佐剂。佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答,发挥其辅佐作用的物质.以前作为佐剂使

12、用时没有免疫原性，但现在有所改变，如IL-2是佐剂和IL-8一类细胞因子佐剂却不一样, 具有免疫调节和免疫增强作用,单独使用时却具有免疫原性。 注意:佐剂和免疫增强剂的关系?有时佐剂也是免疫增强剂.,21,作用特点： 明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生特异性免疫应答。 用最少的抗原和最少的接种次数，产生足够的免疫应答。,22,免疫佐剂作用机理, 改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原； 改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性； 延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，T细胞与B细胞）。,作用方式,23, 抗原递呈（a

13、ntigen presentation） 抗原寻的（antigen targeting） 免疫调节（immune modulation）,作用机理,24,抗原递呈： 指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗联合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。,25,抗原寻的（antigen targeting）指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原与细胞受体的结合等有重要作用。,26,免疫调节（immune modulation） 是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种

14、机制，可以改变特异性免疫应答的本质或强度。T细胞有Th1和Th2两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应。因此，通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确的免疫应答的目的。,27,1. 按佐剂物理性质颗粒型佐剂非颗粒型佐剂 2. 按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法）微生物及其组分非微生物物质 3. 按佐剂在体内存留的时间贮存型佐剂（depot type adjuvant）非贮存型（non-depot type adjuvant）,佐剂的分类,28,（一）颗粒性佐剂 1盐类佐剂氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。 2油水乳剂佐剂弗氏完全佐剂（Freunds complete adj

15、uvant, FCA）、弗氏不完全佐剂（ FIA）和矿物油白油佐剂。 3免疫刺激复合物佐剂（ISCOM） 4蜂胶佐剂（propolis） 5脂质体佐剂（liposomes）。 6其他：MF59佐剂、微囊化佐剂（micro-encapsulation)、硬脂酰酪氨酸佐剂和菊粉等。,29,（二）非颗粒性佐剂 1肽类佐剂（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、去胞壁酰多肽、脂肽和免疫调节多肽。 2表面活性分子类佐剂：海藻糖合成衍生物（TDM） 3核酸及其衍生物类佐剂：合成核苷酸聚合体、CpG 4含硫复合物类佐剂：左旋咪唑 5碳水化合物高分子类佐剂：香菇多糖、DEAE-葡聚糖 6细胞因子类佐剂（cytokine）：IL-2、IL-4和-IFN等。 7脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素 8其他：霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。,