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1、1,第七章 液相色谱(liquid chromatography),7-1 概述 （1）液相色谱简介 （2）液相色谱的发展 （3）液相色谱的分类 7-2 液相色谱仪 （1）液相色谱仪 （2）液相色谱仪的流程图 （3）液相色谱仪的工作过程 （4）液相色谱仪的基本组成系统 （5）高压泵,2,第七章 液相色谱(liquid chromatography),（6）梯度洗脱装置 （7）进样器 （8）色谱柱 （9）色谱填料 （10）检测器 （11）数据处理系统与自动控制单元 7-3 新型液相色谱仪简介 （1） waters的UPLC （2）岛津高效率HPLC-2010A/2010C型 （3）岛津LC-VP
2、系列应用系统离子色谱仪 7-4 液相色谱的应用,3,第七章 液相色谱(liquid chromatography),4,第七章 液相色谱 ( liquid chromatography ),7-1 概述,5,第七章 液相色谱(liquid chromatography) 7-1 概述 （1）液相色谱简介,液相色谱是以液体为流动相的色谱分析方法。英文缩写：LC。 按其固定相的不同，又可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）,6,第七章 液相色谱(liquid chromatography) 7-1 概述 （2）液相色谱的发展,在所有色谱技术中，液相色谱法是最早（1903年）发明的，但其初期发
3、展较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。,7,A： 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高速：HPLC采用高压
4、输液设备，流速大增加，分析速度极快， 只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV10-9g, 荧光检测器10-11g。 B：. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各
5、种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。,8,第七章 液相色谱(liquid chromatography) 7-1 概述 （3）液相色谱的分类,广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相色谱法。不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。但有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。,第七章 液相色
6、谱(liquid chromatography) 7-1 概述 （3）液相色谱的分类,表71 液相色谱分类,10,两种最常用的色谱法,（一）吸附色谱法（adsorption chromatography） 以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。组分的极性越大、固定相的吸附力越强，则保留时间越长。流动相的极性越大，洗脱力越强，则组分的保留时间越短。,11,液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K)的不同而
7、被分离。目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法（简称键合相色谱法）可以用分配色谱的原理加以解释。键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。 按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。,（二）液-液分配色谱法（liquid- liquid chromatography),12,1.正相色谱法（normal phase chromatography),固定相极性大于流动相极性的分配色谱法称为正相分配色谱法，简称为正相色谱法。氰基键合硅胶、氨基键合硅胶等极性的化学键合固定相是正相色谱常用
8、的固定相，正相色谱的流动相一般为极性较小的有机溶剂。在正相色谱中，极性小的组分由于K值较小先流出，极性较大的组分后流出。正相色谱法用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质的分离。,13,流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法，简称为反相色谱法。反相色谱法使用非极性固定相，最常用的非极性固定相是十八烷基硅烷键合硅胶，还有辛烷基硅烷键合硅胶等。流动相常用水与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合溶剂。在反相色谱中极大的组分因K值较小先流出色谱柱，极性较小的组分后流出。流动相中有机溶剂的比例增加，流动相极性减小，洗脱力增强。反相色谱法是目前应用最广的高效液相色谱法。,2.反相色谱法（reve
9、rsed phase chromatography）,14,第七章 液相色谱 ( liquid chromatography ),7-2 液相色谱仪,返回,15,第七章 液相色谱 (liquid chromatography) 7-2 液相色谱仪 （1）液相色谱仪,现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各个所需单元组件组合起来。最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。,16,第七章 液相色谱 (liquid chromat
10、ography) 7-2 液相色谱仪 （2）液相色谱仪的流程图,图71 液相色谱仪的流程图,17,第七章 液相色谱 (liquid chromatography) 7-2 液相色谱仪 （3）液相色谱仪的工作过程,输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。,18,第七章 液相色谱 (liquid chromatography) 7-2 液相色谱仪 （4）液相色谱仪的基本组成系统,1.流动相的流路系
11、统 （高压输液系统：储液器、混合室、高压泵、过滤器、压力脉动阻力器、梯度洗脱装置等组成。核心：高压输液泵） 2.进样系统：进样器（微量注射器或六通阀） 3.分离系统：色谱柱 4.检测系统：示差折光、紫外-可见、荧光、极谱、红外等。 5.信号放大记录系统,19,第七章 液相色谱 (liquid chromatography) 7-2 液相色谱仪 （5）高压泵,高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。通常要求高压泵具有：流量可调、耐高压、液流
12、稳定、死体积小等特点。输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。,20,第七章 液相色谱 (liquid chromatography) 7-2 液相色谱仪 （6）梯度洗脱装置,在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来
13、一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。,21,第七章 液相色谱 (liquid chromatography) 7-2 液相色谱仪 （7）进样器,进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式。进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。除使用自动进样装置外，现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器，实现了常压下不停流进样。,22,六通进样阀可分为定子和转子两部分，共有6个口，故称为六通进样阀。转子通过扳手调节，可以分别处于“装样”和“进
14、样”两个位置。图中a为进样阀处于“装样”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样”位时，进样阀的流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。六通进样阀具有使用方便，进样量准确等优点。样品环有10l、20l、50l等不同容积，可以选配。样品环不仅可以用来贮液，也可用来测量样品溶液的体积。将样品环装满后，进样，进样量即为样品环的容积，此种进样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。用定量环进样精密度好，在使用外标法时，应使用此种操作方式。,23,六通进样阀结构如图所示：,24
15、,第七章 液相色谱 (liquid chromatography) 7-2 液相色谱仪 （8）色谱柱,色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性 能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。 色谱柱： 是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的。色谱柱管： 内部抛光的不锈钢管。色谱往长一般1030cm， 内径25mm。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。,色谱柱的填充,干法填充：在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用漏斗每次灌入50 100mg填料，然后在台面上墩10 20次。,湿法填充：使用专门的填充装置进行填充。,25,第七章 液相色谱
16、 (liquid chromatography) 7-2 液相色谱仪 （9）色谱填料,色谱填料： 经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10 粒径的球形颗粒。,色谱填料,基质： 又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球,功能层： 是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。,化学键合相是广泛使用的固定相，其中又以十八烷基硅烷键合硅胶（octadecylsilyl silicagel，ODS）的应用最为广泛，ODS为非极性化学健合相，此外还有辛烷基硅烷键合硅胶等，非极性化学健合相用于反相色谱法,
