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1、单林娜 制作,1,第5章 DNA复制 (Chapter 4 DNA Replication),单林娜 制作,2,Chapter 4 DNA Replication （DNA复制）,5.1 DNA Replication: An Overview 5.2 Enzymology of DNA Replication 5.3 Bacterial DNA replication 5.4 Eukaryotic DNA replication 5.5 Regulation 0f DNA replication,Molecular Biology Course,第一节 DNA复制概述 (DNA Replic
2、ation: An Overview),一、基本概念 二、DNA的半保留复制 三、复制起点、方式和方向 四、DNA复制的半不连续性,单林娜 制作,4,一、基本概念,DNA复制 亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。,单林娜 制作,5,复制子(Replicon，复制单位或复制元) DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位。 A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to t
3、erminator 复制子的长度大小不均，1.3万90万bp不等。,单林娜 制作,6,在真核生物中，染色体为DNA分子的载体，每条染色体含一个DNA分子。每个DNA分子上含多个复制子。一条染色体上的多数复制子在细胞周期的S期中，在ATP存在下只复制一次。,单林娜 制作,7,mammalian cell 500-5000 bp/min E.coli，37 , 0.5h,105 bp/min,DNA 复制在细胞周期的S期,单林娜 制作,8,二、DNA的半保留复制 （Semi-Conservation Replication）,概念： 复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的
4、互补链与母链构成子代DNA分子 。,单林娜 制作,9,理论上DNA的复制也可采用其它方式，如另一种叫全保留复制(conservative replication)的复制方式也是可能的，在这个模型中两条DNA亲代链保留在一起作为子链合成的模板(图6-1)。,单林娜 制作,10,DNA复制的两种模型,那么，那一种复制方式更为真实呢？,单林娜 制作,11,Semi-conservative mechanism was demonstrated experimentally in 1958 by Meselson and Stahl- Proof 1,1958 Meselson-stahl 设计的Cs
5、Cl超离心试验证实了DNA复制的这一特性。,单林娜 制作,12,CsCl (Cesium chloride) density gradient ultracentrifugation（ CsCl密度梯度超离心） Labeled E.Coli DNA with 15N 14N,DNA replication,单林娜 制作,13,提取DNA，CsCl密度梯度离心,细菌在有15N-标记的培养基上生长多代，使DNA双链充分标记,转入14N 后立即取出 繁殖一代后取出 繁殖二代后取出,单林娜 制作,14,DNA replication,E. Coli DNA在15N-标记的营养液中生长多代，使DNA双链
6、充分标记,万有引力,将15N-标记的E.Coli 加入14N 培养液中,细胞在14N中复制1次,细胞在14N中复制第2次,细胞在14N中复制第3次,单林娜 制作,15,DNA replication,Figure: The expected results of two generations of semiconservative replication in the MeselsonStahl experiment.,单林娜 制作,16,15N 标记实验, 细胞生长在15N 标记培养基中 转入正常N源培养基中 分离各代DNA 分析各代DNA的浮力密度,CsCL密度梯度离心 浮力密度N15D
7、NA 1.742g/mlN15N14DNA 1.717g/mlN14DNA 1.710g/ml,单林娜 制作,17,单林娜 制作,18,三、复制起点、方向和方式,1、复制起点（origin，ori 或 O，复制原点）复制开始处DNA分子的特定位置 原核生物（Prokaryote）：单复制起点，即整个染色体只有一个复制单位,单林娜 制作,19,All prokaryotic chromosomes and many bacteriophage and viral DNA molecules are circles and comprise single replications. （单复制子）,
8、单林娜 制作,20,真核生物（Eukaryote） : 多复制起点，即一个genome中有多个复制单位,单林娜 制作,21,富含AT & 发夹结构 “呼吸作用”十分明显，许多酶的结合位点 真核生物的复制原点约300 bp ,复制起点序列特征,2、复制方向（复制过程的顺序性）,复制叉（Replication fork）：复制时DNA分子中的“Y”形区域，是由解开的两条链和尚未松解开的双螺旋形成的。 在复制叉区域发生双链的不断分离和新链的合成,代表DNA复制中的生长点。复制叉从起始点起沿着DNA合成方向连续向前移动。无论原核或真核细胞，在电镜下均可看到此种复制现象。,单林娜 制作,23,单林娜 制
9、作,24,复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛。,真核生物的多复制子 多个复制眼,Electron Microscopy of replicating DNA reveals replicating bubbles.,单林娜 制作,27,单向复制,双向复制,（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉,单林娜 制作,28,单起点、单方向（原核）,多起点、单方向（真核）,多起点、双方向（真核）,（2） 复制的多模式,单林娜 制作,29,3、复制方式,（1） 从新起始（ de novo initiation ）或复制叉式（ repl
10、ication fork ）或型 （2） 置换式（ Displacement form）又称 D 环复制 （3）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复制（rolling circle replication）,单林娜 制作,30,DNA复制方式,型（西塔型）,线性DNA双链的复制,D-环型,滚环型,单林娜 制作,31,（1）从新起始（ de novo initiation ）或复制 叉式（ replication fork ）或 复制,A replication eye forms a theta structure in circular DNA.,单林娜 制作,
11、32,双向复制,单、双向 复制模式图,单向复制,单林娜 制作,33,线粒体和叶绿体 DNA的复制方式 两条链上的复制起点不对应时产生D-环复制。,（2）置换式 Displacement form 又称 D 环复制,由于复制时产生的滚环结构形状象(sigma)，又称复制 病毒、细菌因子,（3）共价延伸方式 （covalence elongation）或 滚环式复制 （rolling circle replication）,单林娜 制作,35,双螺旋环状亲代DNA,序列特异性内切酶在复制起点产生一个缺口,环状模板链继续伴随3- OH的 共价延伸而“滚动”。,单链子代DNA经切割和重新闭合成环而产生
12、,滚环式复制 （复制）,单林娜 制作,36,四、DNA复制的半不连续性 （Semi-Discontinuous Replication）,单林娜 制作,37,OK !,How ?,合成方向的问题：,DNA聚合酶只能以53方向合成DNA， 事实上没有发现DNA能按35合成的证据,单林娜 制作,38,E.coli t-,2, 7, 15, 30,脉冲标记 dT-H3,0 KCN 杀死,D.S. DNA,S.S. DNA,密度梯度离心,测定 H3-T 放射强度,脉冲追踪,20 in dT-H3 30,正常培养基中数分钟,冈崎片段（Okazaki fragment）1968,D.S. DNA,单林娜
13、制作,39,H3-T,脉冲追踪,脉冲标记,30,15,7,2,新合成的都是1Kb左右的冈崎片段？ 两条链都是不连续合成的？,？,-A- -T-,-A- -T-,-G - -C-,dUTP : dTTP = 1 ：300 cell,dut gene,dUTPase,DNA 中不能有U ?,突变频率 = 1/1200 ！, 半不连续复制的证据,DNA内的dump 片段的存在,少数dUTP,单林娜 制作,41,U,U,denature,单林娜 制作,42,以下实验 证实了这个解释 (1) 在dut- 突变体（dUTPase 缺失）中冈崎片段比在dut+ 中为短。这是因为U 掺入机会增加； (2) 在
14、ung- （尿嘧啶N- 糖苷酶缺失）突变体中新合成的DNA 约有一半由片段组成。这是因为尿嘧啶N- 糖苷酶缺失，不会切除U 的糖苷链，也就不会出现AP 位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保持了半不连续的原貌。,前导链( dUMP片段长度),后随链（冈崎片段的长度）dUMP片段,Okazaki 片段在某种意义上为 dUMP 片段,单林娜 制作,44,先导链(leading strand):DNA复制时，与复制叉向前移动的方向一致，以35链为模板，按53方向连续合成的一条链。 先导链按 dUMP 片段连续复制 后随链（lagging strand）：按Okazaki 片段不连续复制 冈崎片段(Oka
15、zaki fragment): DNA复制不连续合成链中形成的短DNA片段。,单林娜 制作,45,单林娜 制作,46,第二节 DNA复制的酶学 Enzymology of DNA Replication,复习：DNA复制 亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。,单林娜 制作,47,DNA复制的体系,底物： dNTP(dATP dGTP dCTP dTTP) 聚合酶（polymerase): DNA-pol依赖DNA的DNA聚合酶(DDDP) 模板（template): 解开成单链的DNA母链 引物（primer):寡核苷酸片段,提供3-OH末端,使dNTP聚合 其它酶和蛋白质因子: 解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶等,单林娜 制作,48,第二节 DNA复制的酶学 (Enzymology of DNA Replication),重点,一、DNA聚合酶 二、DNA连接酶 三、与DNA几何学性质相关的酶,
