细菌内毒素检查法讲稿课件

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1、1,细菌内毒素检查法 2008年12月 郑州,中国药品生物制品检定所蔡 彤,2,一、背景介绍,热原 细菌内毒素 细菌内毒素检查法反应机理,3,热原,热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质细胞分裂素（ IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ） 内源性热原产生细胞分裂素的物质内毒素热原 外源性热原 非内毒素热原（病毒、细菌、真菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素）,4,细菌内毒素,细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组分之一化学结构含有3个不同的区域 O-特异侧链 核心多糖 类脂A,5,细菌内毒素,致热性 内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原，再刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应 耐热性

2、 分子极性 多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性在水中呈不均匀分布 酸碱性与 强酸强碱水解反应 鲎反应性,6,C因子,活化的C因子,内毒素,活化的B因子,B因子,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白（凝胶）,凝固蛋白原,二价阳离子,(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM,活化的G因子,G因子,细菌内毒素检查法反应机理,能与鲎的血液提取物可发生发生多级酶促反应，形成凝胶,7,细菌内毒素检查法反应机理,在药品生产质量管理规范（GMP）条件下进行药品生产的质量控制，一般可以接受的观点是，不存在内毒素就意味着不存在热原通过检测内毒素控制药品中的热原,8,Boc-leu-Gly-Arg-PNA （鲎三肽）,活化的C因子

3、,C因子,内毒素,活化的B因子,B因子,显色法,凝胶法，浊度法,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白（凝胶）,凝固蛋白原,9,细菌内毒素检查法定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。,二、细菌内毒素检查法介绍,10,细菌内毒素检查包括：限量实验凝胶法半定量实验可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。,浊度法动态浊度法 光度测定法 终点浊度法显色基质法动态显色法终点显色法,二、细菌内毒素检查法介绍,11,细菌内毒素检查 凝 胶 法,12,细菌内毒素检查-凝胶法,1、综述部分实验原理 实

4、验准备 限值（L）的确定 确定最大有效稀释倍数（MVD）,2、实验部分鲎试剂灵敏度复核 干扰实验：预实验正式干扰实验 检 查 法：限量试验 半定量试验,13,C因子,活化的C因子,内毒素,活化的B因子,B因子,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白原,凝固蛋白（凝胶）,二价阳离子,1、凝胶法实验原理,14,37 1下保温反应602分钟 当样品中细菌内毒素的浓度达到或超过鲎试剂的灵敏度时，凝集为坚实凝胶，为阳性，记为“+”。 当样品中细菌内毒素的浓度未达到鲎试剂的灵敏度时，不能凝集为坚实凝胶，为阴性，记为“”。,1、凝胶法实验原理,15,2、凝胶法实验的准备,实验所需物品 细菌内毒素标准物质 细菌内毒素检查

5、用水 凝胶法鲎试剂 漩涡混合器 适宜的恒温器 37 1 电热干燥箱 250 实验器械等,16,细菌内毒素标准物质 国家标准品 以内毒素国际标准品为基准标定效价150600-200707 10000EU/支 工作标准品以内毒素国家标准品为基准标定效价150601-200862 120EU/支,2、凝胶法实验的准备,17,细菌内毒素检查用水 用于复溶内毒素标准品、稀释内毒素及样品、溶解鲎试剂等 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。,2、凝胶法实验的准备,18,凝胶法鲎试剂 8个鲎试剂厂家 灵敏度0.50.03EU/ml 规格0.5ml、0.1ml等,2、凝

6、胶法实验的准备,19,漩涡混合器,2、凝胶法实验的准备,20,适宜的恒温器恒温水浴恒温培养箱干热恒温器,2、凝胶法实验的准备,21,试验器械的要求移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（1075mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、计时器、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。,2、凝胶法实验的准备,22,试验器械的要求 若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。 试验操作过程应防止微生物的污

7、染。,2、凝胶法实验的准备,23,供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的pH值在6.08.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。 缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。,2、凝胶法实验的准备,24,3、限值（L）的确定,中国药典标准、国家药品标准 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/M,25,3、限值（L）的确定,L=K/M L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药

8、途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K2.5EU/kg/h；鞘内用药品，K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/kg/h、mg/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅临床用药须知或药品使用说明书。 中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。,26,3、限值（L）的确定,计算举例： 注射用阿莫西林钠 根据国家药典委员会编纂的临床用药须知: “肌肉注射或稀释后静脉滴注，一次0.51g，一日34次；小儿按体重每日50100mg/kg，分34次静脉滴注。”

9、M成人=1000mg/h60kg=16.67mg /(kgh) M儿童=100mg/(kgh)3=33.3mg /(kgh) L=K/M=5EU/(kgh) 33.3mg/(kgh) =0.150EU/mg,27,3、限值（L）的确定,限值计算时做必要调整的几种情况从严原则 联合用药 特殊情况等,28,4、确定最大有效稀释倍数（MVD）,最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。 MVD=cL/,29,4、确定最大有效稀释倍数（MVD）,MVD=cL/ L：供试品的细菌内毒素限值 c：供试品溶液的浓度 ：在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（

10、EU/ml）,30,4、确定最大有效稀释倍数（MVD）,计算举例： a、当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml 适用于供试品为溶液状态，并且规定限值为应小于xx EU/ml。例：替硝唑注射液 ，计算限值为0.5 EU/ml，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验，则MVD=1.0ml/ml0.5 EU/ml 0.125 EU/ml=4倍,31,4、确定最大有效稀释倍数（MVD）,计算举例： b、当L以EU/mg或EU/U表示时，浓度c的单位需为mg/ml或U/ml 。适用于供试品为固体状态，如粉针；或液体但是规定限值为应小于xx EU/mg或EU/U 。,32,4、确定最

11、大有效稀释倍数（MVD）,例：注射用阿莫西林钠 计算限值为0.15 EU/mg，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验。需先称取一定重量的注射用阿莫西林钠 ,在已除去外源性内毒素的容器中,用细菌内毒素检查用水配制成一定浓度的溶液。如称取100mg注射用阿莫西林钠 ，用5ml内毒素检查用水溶解，即成为浓度为20mg/ml的阿莫西林钠溶液。MVD=20mg/ml0.15 EU/mg0.125 EU/ml=24倍,33,4、确定最大有效稀释倍数（MVD）,如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，计算供试品的最小有效稀释浓度c=/L；适用于供试品为固体的情况。计算得到的最小有效稀释

12、浓度即为MVD下的该供试品的浓度。例：注射用阿莫西林钠 计算限值为0.15 EU/mg，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验。最小有效稀释浓度c=0.125EU/ml0.15EU/mg=0.833mg/ml,34,细菌内毒素检查-凝胶法,2、实验部分鲎试剂灵敏度复核 干扰实验：预实验正式干扰实验 检 查 法：限量试验 半定量试验,35,鲎试剂灵敏度复核试验,目的：不仅是考察鲎试剂灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。,36,鲎试剂灵敏度复核试验,实验操作: 取细菌内毒素国家标准品或

13、工作标准品一支，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。 然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2.0、1.0、0.5、0.25（为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。,37,鲎试剂灵敏度复核试验,38,鲎试剂灵敏度复核试验,放入371的恒温器中，保温60分钟2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性。 保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。,39,坚实凝胶 阳性“+

14、”,40,未形成凝胶 凝胶不坚实 阴性“”,41,鲎试剂灵敏度复核试验,结果判断： 若最大浓度2管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。 结果计算： 反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（c）。c=lg-1（X/4） 式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。,42,鲎试剂灵敏度复核试验,+,0.5 ,0.5 ,c= lg-1（(lg +lg +lg0.5 +lg0.5 )/4)=0.707 ,+,+,+,+,+,+,+,+,+,43,鲎试剂灵敏度复核试验,当c在0.52（包括0.5和2）

15、时，方可用于细菌内毒素检查。以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。,44,凝胶法干扰试验,目的：是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。未进行过内毒素检查法验证的样品 当供试品的配方和工艺有变化，或供试品阳性对照结果呈阴性时验证供试品是否存在干扰作用。,45,凝胶法干扰试验,试验操作：在干扰试验中，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液。解释：即与所使用的鲎试剂反应，不出现阳性的供试品溶液。,46,凝胶法干扰试验,试验操作：预试验正式干扰实验,47,凝胶法干扰试验,预试验 目的：初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/u活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰实验提供依据。 优点：减少摸索过程、节省成本,