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1、生物化学实验理论教学课件 第一讲 分光光度计的结构与使用方法,主讲教师：徐文俊 成都大学生物产业学院 2008年6月,教学目的：,1. 掌握分光光度法的定义和在实践中的应用；2. 掌握分光光度计的基本结构和工作原理；3. 掌握可见光分光光度计的正确使用方法；4. 掌握紫外分光光度计正确使用方法；,几个基本概念：,1. 什么叫可见光？白光（复合光）？单色光？2. 可见光由哪几种单色光组成？什么叫互补色？,3. 物质的颜色与可见光选择性吸收有什么内在联系？（1） 对于固体物质：黑色；白色与彩色（2） 对于溶液：矿泉水; CuSO4 ; KMnO4溶液等,例如：黄光与 光互补； 绿光与 光互补； 红
2、光与 光互补等。,蓝,紫,青,教学内容：,1. 分光光度法定义与应用,2. 分光光度计的基本结构和工作原理,3. 以7200可见光分光度计为例，掌握可见,4. 以UV-754型紫外-可见分光光度计为例，,掌握紫外光光度计的正确使用方法。,光分光度计的正确使用方法。,1. 分光光度法定义与应用,1.1 定义: 无论物质有无颜色，当一定波长的光通过该物质的溶液时，根据物质对光的吸收程度，准确测定物质含量的方法。（什么叫比色法？）1.2 特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。（10-5 10-6 M)1.3 应用: 生物化学微量物质定量分析测定
3、研究中广泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。,2. 分光光度计的基本结构和工作原理,2.1 分光光度计的分类,2.2 分光光度计工作原理,2.3 分光光度计的基本结构,2.4 分光光度法的测量误差,2.5 显色反应及其影响因素,2.1 分光光度计的分类,分光光度计的分类,红外分光光度计:可见光分光光度计:紫外分光光度计:,测定波长范围为大于760 nm的红外光区 测定波长范围为400760 nm的可见光区 测定波长范围为200400 nm的紫外光区,2.2 分光光度计工作原理,人眼可见的光(一种频率较大的电磁波)只占电磁波谱的很小一部分（400760nm）。电磁波按频
4、率大小，从频率最小的无线电波到频率最大的-射线排成一列，即组成电磁波的波谱，如下图所示。,2.2.1 分光光度计的光谱范围,包括波长范围为400760 nm的可见光区和波长范围为200400 nm的紫外光区。不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的400760nm波长的光谱，光通过三棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该色谱可作为可见光分光光度计的光源。氢灯的发射光谱：氢灯能发出185400 nm波长的光谱，可作为紫外光光度计的光源。,2.2.2 物质的吸收光谱（1）,如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液
5、，此时在屏上所显示的光谱已不再是原光源的光谱，它出现了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱。不同物质的吸收光谱是不同的。因此根据物质最大吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质。,2.2.2 物质的吸收光谱（2）,当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液。 入射光 = 反射光 分散光 吸收光 透过光如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为“空白”去校正反射、分散等因素造成的入射光的损失，则： 入射光 = 吸收光 十 透过光,2.2.3
6、物质吸光度（A）与透射比（T）的关系,设 I0 为经过空白校正后入射光的强度；I 为透过光的强度。根据实验得知 I = I0 10c l式中，c 表示吸收物质的摩尔浓度；l 表示吸收物质的光径，用cm表示；表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对光的吸收特性，不同物质的数值不同。 所以 I / I0 = 10c l 令 T（透射比） = I / I 0 T = 10cl 若以T对吸收物质的浓度作图，则得下图中的曲线。由上式可得 1g（1 / T） = c l log（l / T）即为物质的吸光度（A） A = c l,2.2.4 Lambert -Beer定律（ A = cl）,上式说明：物质
7、的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比。这就是光吸收的基本定律-Lambert-Beer（朗伯-比耳）定律。,物质的浓度与透射比及吸光度的关系,2.3 分光光度计的基本结构,无论哪一类分光光度计都包括 ：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示:,5个基本部件,分光光度计的基本部件（1）:,光 源: 分光光度计上常用的光源有两种：钨丝灯或氢灯，在可见光区、近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源；在紫外光区多使用氢弧灯。单色器：把混合光波分解为单波长光的装置。在分光光度计中多用 作为色散元件。吸收池：（比色杯、比色皿、比色池）一般由玻璃、石英或熔凝石英制成，用
8、来盛被测的溶液。在低于350 nm的紫外光区工作时，必须采用石英池或熔凝石英池。,棱镜或光栅,分光光度计的基本部件（2）:,吸收池（比色皿）必须与光束方向垂直。此外，每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生误差。比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性，因此在使用前务必彻底清洗。,检测器,测量装置 一般常用的紫外光和可见光分光光度计有3种测量装置，即电流表、记录器和数字示值读数单元。现代的仪器常附有自动记录器，可自动描出吸收曲线。,有光电池、光电管和光电倍增管三种。,棱镜与光栅,棱 镜： 光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同；因而能将不同波长的光分开。玻璃对紫外线的吸收力强
9、，故玻璃棱镜多用于可见光分光光度计。石英棱镜可在整个紫外光区传播光，故在紫外光分光光度计中广为应用。衍射光栅： 在石英或玻璃表面上刻划许多平行线(每英寸约刻15 00030 000条)。由于刻线处不透光，通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大，较短的光波偏折角度小，因而形成光谱。,棱镜单色器装置示意图,光源照到棱镜（或光栅）以前，先要经过一个入射狭缝，再通过平行光镜使成为平行光束投到棱镜上。透过棱镜的光再经另一聚光镜，在此聚光镜的焦面内可得一清楚的光谱图。如在焦线处放一出射狭缝，转动棱镜使光谱移动，就可以从出射狭缝射出所需要的单色光。整个装置称为“单色器”,检测器-光电池,光电池 装在一个特
10、制的匣子里面由3层物质组成的圆形或长方形薄片。第一层是一种导电性良好的金属，这是光电池的负极。中间极薄的一层是半导体硒，第3层是铁，这是光电池的正极。当光电池受光照射以后，半导体硒的表面逸出电子，这些电子只向负极方向移动，而不向正极移动，因此在上下两金属片间产生一个电位差，线路连通时即产生电流,检测器-光电管,光电管 光电管是由封装在真空透明封套里的一个半圆柱型阴极和一个丝阳极组成。阴极的凹画上有一层光电发射材料，此种物质经光照射可发射电子。当在两极间加有电位时，发射出来的电子就流向丝阳极而产生光电流。对于相同的辐射强度，它所产生的电流约为光电池所产生电流的1/4。由于光电管具有很高的电阻，所
11、以产生的电流容易放大 。,检测器-光电倍增管,光电倍增管 它比普通的光电管优越，它可将第一次发射出的电子数目放大到数百万倍 。当电子打在兼性阳极上时，能引起更多的电子自表面射出。这些射出的电子又被第二个兼性阳极所吸引，同样再产生更多的电子。,此过程重复9次后，每个光子可形成106107个电子。这些电子最后被收集在阳极上。所得到的倍增电流可进一步加以放大和测量。,2.4 分光光度法的测量误差,分光光度法的测量误差,选择适宜波长的入射光控制吸光度A的遍数范围选择适当的参比溶液,仪器测 量误差,测量条 件选择,2.4.1 仪器测量误差,由朗伯-比尔定律可知，只有在一定的浓度范围内，即一定的吸光度范围
12、同内，由分光光度计测量所引起的测定结果的相对误差才是较小的；当透光率接近0或1.0时，其相对误差趋于无限大；一般在百分透光率在1080%的范围内（即吸光度在10.1），浓度测量相对误差较小；对于精密度高的仪器。当吸度A=0.7-0.2时（百分透光率约为20-60%，测量误差约为1%。,2.4.2 测量条件选择,（1）选择适宜波长的入射光：由于有色物质对光有选择性吸收，为了使测定结果有较高的灵敏度，必须选择溶液最大吸收波长的入射光。（2）控制吸光度A的准确的读数范围：由朗伯-比耳定律可知，吸光度只有控制在0.20.7读数范围内时，测量的准确度较高。（3）选择参比溶液：参比溶液是用来调节仪器工作零
13、点的。若样品溶液，试剂，显色剂无无色可用蒸馏水作参比溶液；反之应采用不加显色剂的样品液作参比溶液。,2.5 显色反应及其影响因素,显色反应及其影响因素,显色反应 一般要求,影响显色 反应因素,选择性好 灵敏度高 生成的有色化合物性质稳定 显色剂与有色物颜色反差大 显色反应要易于控制,显色剂用量 反应液的酸碱度（pH） 反应温度 显色反应时间 干扰离子的影响,2.5.1 显色反应一般要求,（1）选择性好：显色剂最好只与一种被测组分起显色反应；（2）灵敏度高：灵敏度高，能进行微量组分的测定；（3）有色化合物性质稳定：确保前后测定准确。（4）显色剂与有色物颜色反差大：两者最大吸收波长之差应大于60n
14、m；（5）显色反应要易于控制：结果的确保实验再现性。,2.5.2 影响显色反应的主要因素,（1）显色剂用量：通过实验来确定最适用量；（2）反应液的酸碱度（pH）溶液酸碱度直接影响金属离子与显色剂存在形式以及有色化合物组成的稳定性。（3）反应温度：不同的显色反应需要不同的反应温度，一般显色反应可在室温下完成。（4）显色反应时间：显色反应的速度有快有慢。（5）干扰离子的影响：应采用适当方法消除其影响。,3. 7200型分光光度计的正确使用方法,3.1 结构和工作原理 3.1.1 仪器结构,3.3 注意事项,3.2 使用方法,3.1.3 特 点,3.1.2 工作原理,3.1.1 7200型分光光度计
15、仪器结构,7200型光栅分光光度计由光源、单色器、试样室、光电管、线性运算放大器、对数运算放大器及数字显示器等部件组成，基本结构如下图所示。,1光源；2单色器；3试样室；4光电管；5线性运算放大器；6对数运算放大器；7数字显示器,3.1.2 7200型分光光度计工作原理（图）,7 2 0 0型光栅分光光度计光学系统示意图,1.光源灯；2.滤光片；3.球面反射镜；4.入射狭缝；5.保护玻璃；6.平面反射镜；7.准直镜；8.光栅；9.保护玻璃；10.出射狭缝； 11.聚光镜；12.试样室； 13.光门；14.光电管；,3.1.2 7200型分光光度计工作原理（文）,由光源灯(1)发出连续辐射光线，
16、经滤光片(2)和球面反射镜(3)至单色器的入射狭缝(4)聚焦成像，光束通过入射狭缝(4)经平面反射镜(6)到准直镜(7)产生平行光，射至光栅(8)上色散后又以准直镜(7)聚焦在出射狭缝(10)上形成一连续光谱，由出射狭缝选择射出一定波长的单色光，经聚光镜(11)聚光后，通过试样室(12)中的测试溶液部分吸收后，光经光门(13)再照射到光电管(14)上。调整仪器，使透光度为100，再移动试样架拉手，使同一单色光通过测试溶液后照射到光电管上。如果被测样品有光吸收现象，光量减弱，由光电转换元件将变化的光信号转变为电信号，经线性运算放大器和对数运算放大器处理，将光能的变化程度通过数字显示器显示出来。可根据需要直接在数字显示器上读取透光度(T)、吸光度(A)或浓度(C)。,
